论文部分内容阅读
哺乳类17β-羟类固醇脱氢酶通过催化17-酮基类固醇和17-羟基类固醇之间的相互转化，如：脱氢表雄酮(Dehydroepiandrosterone)和雄烯二醇(Androstenediol)，雄烯二酮(A)(Androstendion)和睾酮(T)(Testosterone)，以及雌酮(E1)(Estrone)和雌二醇(E2)(Estradiol)，因而在性类固醇激素，特别是雌激素和雄激素合成代谢的最终反应中有重要作用。17β-HSD1，17β-HSD3分别为催化雌激素和雄激素合成的关键性酶，其中17β-HSD1在卵巢的表达水平很高，并能高效地催化雌酮到雌二醇的转化；而17β-HSD3是精巢特异的，并特异性地催化雄烯二酮到睾酮的转化。17β-HSD8主要在肾脏和性腺表达，而它的突变导致小鼠多囊肾。在本实验中我们克隆了罗非鱼这三种类型的17β-羟类固醇脱氢酶的cDNA(17β-HSD1，3，8)，通过RT-PCR、Northern杂交检测其表达和组织分布，构建重组质粒进行离体表达，并通过薄层色谱进行酶活性分析。 首先从GeneBank下载在其他脊椎动物中已被克隆17β-HSD1，17β-HSD3的氨基酸和核甘酸序列，并在序列保守区域设计简并引物，然后分别以罗非鱼卵巢和精巢cDNA为模板进行RT-PCR扩增得到17β-HSD1，17β-HSD3的中间片段。而17β-HSD8的3’端片段从罗非鱼EST(expression sequence tags)克隆中获得。通过筛选卵巢cDNA文库获得17β-HSD1全长cDNA序列，而17β-HSD3和17β-HSD8的全长cDNA序列通过快速扩增cDNA末端(RACE)和末端RT-PCR扩增得到。从罗非鱼克隆的三种类型17β-羟类固醇脱氢酶(17β-HSD1，17β-HSD3，17β-HSD8)的cDNA全长序列分别是：1054bp、1963bp、1006b0，其开放阅读框编码的氨基酸序列分别为：289AA、325AA、256AA。罗非鱼的三种类型17β-HSDs在氨基酸水平上与其他已克隆的相应17β-HSDs都有较高的同源性。 通过三种17β-HSD的基因特异性引物进行RT-PCR分析和Northern杂交实理学硕十学位论文:罗非鱼三种17p一轻类固醉脱氢酶(1 7p一HsDI .17p一HsD3.17p一HsOS)的克隆表达及酶活性鉴定验发现，17p一HSDI的表达是卵巢特异性的，而17p一HSD3仅仅在精巢有表达。17p一HsDS在雌雄的性腺、鳃、心脏、肝脏、肠和肾脏都有高水平表达。 在罗非鱼14天的产卵周期中，17p一HSDI在卵巢的表达水平与卵子成熟过程中雌激素的水平密切相关。同时，17p一HSDI和17p一HSD3在个体发生过程中都是从孵化后50夭左右才开始表达，而此时，罗非鱼的性腺分化己经非常明显，配子发生刚刚开始。由此表明，这两种酶都可能在配子发生过程中有重要作用，而可能没有参与性别决定和分化过程。而17p一HSDS早在胚胎发育的5天己经开始表达，因而可能在罗非鱼性别分化的早期起重要作用。 酶活性实验结果显示，在E.coli细胞中表达的17p一HSDI/P ET BlueZ重组蛋白既能高效地催化A和T之间的相互转化，同样又能更高效地催化E1和EZ之间的相互转化。并且以NADP(功为辅酶的转化率稍高于NAD(H)存在的反应，罗非鱼17p一HSDI与哺乳类相似是NADp(H)依赖的。但罗非鱼i7p一Hsni重组蛋白催化从EZ到El的氧化反应是不依赖辅酶的，即使没有辅酶的存在，其转化率同样可以达到98.5%。而17p一HsDS转染HEK293细胞表达的17p一HSDS/PcDNA 3.1重组蛋白能微弱地催化El和EZ之间的相互转化，同时也能催化从T到A的氧化反应。但在我们的实验中，不论是在原核细胞诱导表达，还是通过转染真核细胞表达的罗非鱼17p一HsD3重组蛋白都没有发现其酶催化功能。