[目的]在骨折的愈合过程中,参与的细胞因子和细胞较多,机制十分复杂,血液供应不足是造成骨折延迟愈合或骨折不愈合的重要因素。骨折后的血液流动中断必然会导致骨折部位的缺氧环境,随之会造成细胞死亡,导致软骨细胞和成骨细胞的分化延迟以及骨折愈合过程受损.因此更好的了解在缺血缺氧条件下的骨折愈合作用机制,有助于我们探索促进骨折愈合的新型治疗方法。在骨折后,局部会进入低氧状态,因此低氧诱导因子-1Q对于骨折愈合后骨不连的影响十分大,其调控过程有着至关重要的作用。低氧诱导因子是专家Semenza等发现的,属于一种转录激活因子,对氧有着较大的依赖性,其主要包括了两组亚基,分别为⒑和β,组成了异二聚体蛋白。本文主要研究骨折标本和缺氧条件下的成骨细胞中的microRNA-210的表达水平,详细了解了microRNA-210在成骨细胞中的过量表达对成骨细胞的增殖和凋亡产生的影响,以及microRNA-210调控成骨细胞增殖可能的机制；并且通过动物实验研究了小鼠成骨细胞在氧化钴诱导的化学模拟缺氧状态下,凋亡造成骨不连的相关情况,为探索缺血缺氧条件下的骨折愈合作用机制,研究促进骨折愈合的新型治疗方法提供基础实验参考。[方法]第一部分：1.人体组织样本本研究使用的所有骨折组织和正常骨骼组织均获得了武汉大学人民医院内部审查委员会(IRB)的批准。34份骨折组织样品的来源为股骨粉碎性骨折,是直径小于0.5cm不适合复位术的骨组织标本,在骨折后24-38小时内获得。另外18份的正常骨骼组织来自股骨移植的剩余部分骨组织标本。所有的组织样本在使用前均在-80℃深低温冰箱中保存。2.细胞培养和试剂处理人MG-63成骨细胞由武汉大学细胞中心提供,使用含有10%胎牛血清的Eagle’s Minimum Essential Medium (EMEM)培养液培养,于37℃、5%CO2的环境下生长。低氧环境的处理则是将细胞置于含5% CO2和2%氧气的缺氧孵箱中。连续监测孵箱中氧气浓度。MG-63细胞缺氧或常氧处理0,12,24,48或72h,然后收集分离miRNA或mRNA,用于细胞蛋白提取或细胞凋亡分析。使用RNA干扰技术敲除HIF-1α的表达,使用的HIF-1α特异性干扰质粒siHIF-1α(CUC AAG CAA CUG UCA UAUA)和siHIF-1α 2 (UGC CAC CAC UGA UGA AUUA),以及小干扰RNA(siRNA) (UAA GGC CAG ACG CGA AUUA)。MG-63细胞通过脂质体2000转染50nM的siRNA寡核苷酸,6小时后上清换液细胞用于接下来的处理。microRNA-210类似物(CUG UGC GUG UGA CAG CGG CUGA)或对照类似物(UCA CAA CCU CCU AGA AAGA) (QIAGEN, Valencia, CA, USA)则用于控制nicroRNA-210的水平。25nm或50nm的microRNA-210类似物/对照类似物使用脂质体2000转染MG-63细胞。浓度为5μg/ml或40μg/ml时可诱导MG-63细胞的凋亡过程。3.RNA分离,反转录,实时定量PCR细胞内总RNA的提取反转录过程则使用M-MLV Reverse Transcriptase。在mRNA水平进行的HIF-1α的RT-qPCR检测,所有mRNA的表达水平均以β-肌动蛋白(β-actin)为标准。miRNA样本分离提取,microRNA-210表达的定量检测,并以U6小核RNA作为检测的内参,结果用AΔCt方法进行相对定量。4.蛋白样品的制备和免疫印迹法(western blot)分析使用加入蛋白酶抑制剂混合物的细胞溶解试剂提取细胞内总蛋白。抗HIF-1α的兔多克隆抗体(Abcam, Cambridge, UK),半胱天冬氨酸水解酶3或半胱天冬氨酸水解酶9用于检测HIF-1α的水平,使用免疫印迹法检测裂解的caspase 3(CASP3)或裂解的caspase 9 (CASP 9)水平。检测的内参为β-actin,可与抗β-actin的兔多克隆抗体发生特异性结合。使用辣根过氧化物酶共轭的山羊抗兔和ECL检测系统进行检测。5.细胞增殖、细胞集落形成和细胞凋亡测定用5μg/mL 5-FU处理的MG-63细胞,在注入microRNA-210或对照转染类似物24,36或48h后,使用CCK-8进行孵育。当出现肉眼可见的颜色变化后检测细胞450nm光谱下的吸光度。细胞集落使用12孔板在37℃、5% CO2条件下培养约103个细胞,并进行0nm或者50nm的microRNA-210类似物或对照类似物的转染实验,然后作用2-5天。细胞用结晶紫(0.005%)染色20min后进行克隆计数。MG-63细胞凋亡的检测,约有5×105个细胞使用膜蛋白V-FITC和碘化丙啶染色,并用流式细胞仪检测(Biosciences)。CellQuestTM Pro软件进行结果的计算,并评估凋亡细胞占总细胞数的比例。第二部分：取妊娠19d的KM小鼠的颅骨,应用改良组织块法培养原代鼠胚成骨细胞,同时对细胞使用贴壁法纯化处理,再行对第3代培养的细胞计数持续一周,同时对已经培养的第4代细胞进行成骨细胞鉴定,并使用钙-钻染色法检测细胞的碱性磷酸酶。在125umol/L浓度的氯化钻常规DMEM培养液中培养第3代的成骨细胞,随后予以氯化钴化学模拟低氧状态,应用倒置相差显微镜观察低氧下培养的细胞并作好计数,随后将不同时间培养的成骨细胞设为0、1、3、5以及7d缺氧组,并将常规氧条件下培养的第3代细胞设为0、1、3、5以及7d常规氧气组。再对低氧组与常规氧气组不同时间的成骨细胞进行检测,分析HIF-1p表达及凋亡所致骨不连情况。同时采用免疫印迹法检测成骨细胞中的Bcl-2与Caspase-3蛋白表达情况。[结果]第一部分：1.microRNA-210在人类骨折样本中的含量上调,且与HIF-1α相关在34份骨折患者样本中,其均值(士标准差)的AACT值为1.87士1.23,而在健康对照组中的这一数值为1.00±0.32(p<0.01；图1A)。与对照组相比骨折组织中的HIF-1α mRNA的表达量要显著提高(p<0.01)。在骨折患者中microRNA-210的表达与HIF-1α mRNA的表达成正相关(R2=0.3626,p<0.01)2.microRNA-210表达量的上升受HIF-1α调控采用RT-PCR技术来测定MG-63成骨细胞系在常氧或缺氧情况下,其microRNA-210的表达情况。与临床样本的实验结果相符,缺氧成骨细胞系的microRNA-210表达量更高,且其体外表达量与时间存在相关性,在缺氧处理24h后,microRNA-210受缺氧环境影响其表达量显著上升,此外受缺氧环境影响HIF-1α在mRNA水平和蛋白水平的表达均上调,通过HIF-1α特异性的siRNA-1或siRNA-2显著降低了HIF-1α的mRNA水平(siHIF-1α-1或siHIF-1α-2均p<0.01)。且siHIF-1α-1或siHIF-1α-2能够有效地消除缺氧促进的miRNA-210表达上调的现象。3.microRNA-210类似物可减少5-FU引起的细胞死亡现象并促进成骨细胞的生长相较于对照组,microRNA-210类似物可使MG-63细胞中的microRNA-210水平明显增高(25或50 nM p<0.001)。相较于对照miRNA, microRNA-210类似物减少了5-FU依赖时间和剂量引起的MG-63细胞的死亡,MG-63细胞在转染50nm的microRNA-210类似物后比转染50nnm的对照miRNA后具有更高的聚落形成能力(p<0.05)。4.microRNA-210类似物能够改善的体外成骨细胞因缺氧引起的细胞凋亡现象在常氧培养条件下,5-FU引起的细胞凋亡仅有轻微的时间增长现象,但是在5-FU和缺氧的共同刺激下MG-63细胞的凋亡现象明显增多。在使用低剂量的5-FU处理的情况下,裂解的CASP 3和裂解的CASP 9在缺氧条件下的表达量要比在常氧条件下的表达量显著升高(图5B和5C)。缺氧处理48h后,没有转染microRNA-210类似物的MG-63细胞开始出现凋亡(处理后48h或72h p<0.05)。裂解CASP 3和裂解CASP 9的免疫印迹实验结果再次证实了microRNA-210且有抑制缺氧引起的细胞凋亡的功能,而且从转染了microRNA-210的MG-63细胞中能分离到的CASP 3和CASP 9很少。第二部分：成骨细胞有较多的突起,多为三角形、多角或者短梭形,轮廓较为清晰,部分突起会与远处细胞突起有一定的连接,细胞核呈现椭圆或者圆形,能够清晰发现1个或者3个核仁,在倒置显微镜下观察,细胞的扩增速度十分缓慢在第6d达到了高潮,随后增长继续呈现缓慢趋势,同时数量有所减少,在第4代培养的碱性磷酸酶细胞染色结果中,可见少量细胞质内出现颗粒状物质且在细胞周围呈现分散状,在经氯化钴处理后,细胞膜边界模糊,且出现皱缩,同时形态学上发现细胞质较为致密,核染色质呈现边集化,在处理后7d,能够发现细胞核已经裂解,对处理后的细胞进行计数处理,可发现细胞数量在第5d至高峰,但仍旧远远低于常规氧气组,随后细胞数量开始快速下降。同时发现氯化钴处理后,低氧诱导因子-1α与Caspase-3 mRNA表达会随着时间的递增而呈现增加(P<0.01),除了初始阶段,其他时间段均要高于常规氧气组(P<0.01),常规氧气组在各个时间段无明显变化,统计学比较,差异无统计学意义(P>0.05)；但Bcl-2 mRNA表达情况却与前两者相反,随着时间递进,会表现出下降的趋势(P<0.01),除了初始阶段,其他时间段均要低于常规氧气组(P<0.01),而常规氧气组在各时间段无显著变化(P>0.05)。通过免疫印迹法检测发现,在氯化钻处理后,Caspase-3蛋白的表达呈现逐渐增加趋势(P<0.01),除了初始阶段,各个时间段均要高于常规氧气组(P<0.01),常规氧气组在各时间段无显著变化(P>0.05)；而Bcl-2蛋白表达情况与前两者相反,呈现降低(P<0.01),除初始阶段,均要明显低于常规氧气组(P<0.01),常规氧气组在其他各时间段无显著变化(P>0.05)。[结论]1.在临床人体骨折组织中microRNA-210表达量的上调与HIF-1α因子的过量表达相关,且在MG-63成骨细胞依赖HIF-1α的缺氧型应答中表达量上调。2.通过microRNA-210类似物提高microRNA-210的表达量以减少化疗药物5-氟尿嘧啶(5-FU)诱导的成骨细胞死亡现象3.集落形成实验显示microRNA-210类似物能够促进成骨细胞的生长。4. microRNA-210类似物的转染能够通过抑制caspase-3(细胞凋亡蛋白酶3)和caspase 9(细胞凋亡蛋白酶9)的激活来抑制缺氧诱导型MG-63细胞的凋亡现象5.改良组织块法具有传统组织块法所有的优点,能够短时间内得到较多的成骨细胞,所培养细胞有典型的成骨细胞功能及形态,在氯化钴化学模拟出的低氧状态下,促进成骨细胞凋亡并产生大量的低氧诱导因子HIF-1α,该因子可以通过对Caspase-3和Bcl-2蛋白的调节来促进成骨细胞发生凋亡并致骨不连形成,且这种促进与缺氧的时间有着密切关系。