论文部分内容阅读
在哺乳动物体内,X染色体失活(X-chromosome inactivation,XCI)是用于补偿两性之间X染色体数目不同的重要过程。该过程主要是由位于X染色体失活中心(X-inactive certre,Xic)的Xist基因引发的。Xist基因是一种长链非编码RNA,在人类细胞内可转录约17 kb。转录产物Xist RNA顺势覆盖至X染色体上,通过和互作蛋白结合,招募多梳蛋白抑制复合体(PRC1/PRC2),蛋白复合体会招募甲基化、泛素化、乙酰化等修饰物,修饰X连锁基因启动子CpG区域,使得X染色体上大部分连锁基因沉默,从而达到X染色体失活的状态。X染色体失活失效或Xist RNA的异常表达会引起胚胎致死、癌症等疾病,这一现象表明Xist基因在哺乳动物胚胎发育与个体生长过程中扮演着重要的角色。人类XIST基因位于Xq13.3的X染色体失活中心区域内,包含6个重复区域:Repeat A,Repeat B,Repeat C,Repeat D,Repeat E和Repeat F。除此之外,Xist基因5’端具有一个最小启动子(minimal promoter,P1),在不同物种中P1序列具有高度保守性。目前人细胞水平的研究结果已表明,该启动子与常见转录因子SP1、YY1和TBP绑定,使最小启动子(Xist P1)获得激活Xist基因表达的能力。在X染色体失活之前,两条X染色体上的Xist基因在最小启动子(Xist P1)的作用下表达转录,并在之后进入一条X染色体Xist基因抑制而X染色体表达的状态,但是最小启动子(Xist P1)在动物水平的研究仍处于空白状态。X染色体失活的模式,在不同物种之间略有不同。对于小鼠而言,首先发生在四细胞-八细胞期间,父系X染色体(Paternal X Chromosome,Xp)印记性X染色体失活(Imprinted X-chromosome inactivation,iXCI)。直至桑椹胚-囊胚期,内细胞团(ICM)细胞中失活的X染色体被“激活”,之后内细胞团的父系X染色体或母系X染色体发生随机失活。而在人类细胞中X染色体失活机制具体模式如下:在人胚胎早期,不会发生印记性X染色体失活。直至在囊胚后期,人胚胎内出现父系X染色体或母系X染色体的随机X染色体失活(Random X-chromosome inactivation,rXCI)。兔X染色体失活模式是同人一致的随机X染色体失活,小鼠与人类的X染色体失活模式不一致,因此限制了小鼠作为动物模型用于研究人Xist基因。兔作为经典的模型动物,其生理结构与人类更为相似,并妊娠周期短、饲养费用低。此外,在本实验中兔与人X染色体失活模式一致,皆为随机X染色体失活,并且Xist P1序列高度保守,兔成为理想的动物模型,用以理解和研究人X染色体失活机制以及相关疾病。因此,本研究利用CRISPR-Cas9技术构建Xist P1基因敲除兔模型。本研究中,我们成功获得了Xist P1基因敲除兔模型,并且经过检测未出现脱靶现象。通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)与转录组测序(RNA-seq)对Xist RNA表达量和X连锁基因表达量进行检测,结果发现:Xist P1基因敲除兔Xist RNA表达量正常,X连锁基因表达量具有上调和下调的变化。随后,通过对X连锁基因与常染色体基因表达量的整体水平进行比对,结果表明X连锁基因整体水平正常,且X染色体失活现象正常发生。最后,通过RNA分子原位杂交检测Xist RNA定位,结果表明Xist P1基因敲除兔Xist RNA定位未受到影响。综上所述,本研究是首次报道用兔作为动物模型来研究Xist P1的功能,并且成功构建出Xist P1敲除动物。结果表明,Xist P1不调控X染色体失活,这与先前文献报道的在细胞水平中,Xist P1具有激活Xist基因表达功能的结论不一致。我们获得的Xist P1敲除动物相对于细胞而言更接近于人体内X染色体失活机制,因此我们的这一结果为Xist功能的探索提供了新思路,Xist作用的研究提供了新视野。