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研究目的通过先前研究得到的微阵列基因芯片结果—激素性股骨头坏死与股骨颈骨折两组患者BMSCs差异表达的1nc RNA,通过生物信息学分析预测LINC-STXBP5-AS1与mi R-378a-5p两者存在相互作用的靶向关系,确定其可能的下游靶基因为Su Fu,Su Fu是Hedgehog信号通路重要的组成因子,因此可能存在LINC-STXBP5-AS1/mi R-378a-5p/Su Fu/Hedgehog信号通路轴。据此,本研究的目的在于,通过体外实验验证LINC-STXBP5-AS1可通过与mi R-378a-5p的相互作用,进而激活Hedgehog信号通路来调控地塞米松诱导下的细胞凋亡。本研究具体分:第一部分:SONFH患者BMSCs差异表达lnc RNA的验证方法:(1)经SONFH患者与股骨颈骨折患者知情同意后在THA手术中收集股骨骨髓,随后使用全骨髓贴壁法分离得到BMSCs。细胞传代培养来纯化BMSCs,使用流式细胞分析法检测细胞的表面抗原CD34、CD45、CD73和CD90的表达,并分别使用含有成骨与成脂诱导成分的培养基培养P3代细胞,观察其成骨与成脂分化的能力。(2)通过生物信息学方法,选取与1nc RNA存在结合位点的mi RNA,通过q RT-PCR技术,检测其在SONFH和股骨颈骨折两组患者BMSCs中的表达情况,进一步验证基因芯片结果。(3)采用SPSS 26.0软件对实验结果进行统计学分析。结果:(1)流式细胞分析结果显示,P3代的细胞表达间充质干细胞特异性表面抗原CD73(95.50%)和CD90(92.00%),但几乎不表达造血干细胞特异性表面抗原CD34(0.22%)和CD45(0.24%),说明通过全骨髓贴壁法后传代培养的细胞纯化度较高,可用于之后的实验。(2)qRT-PCR结果显示,与股骨颈骨折患者组相比,激素性股骨头坏死患者组的BMSCs中LINC-STXBP5-AS1的表达显著升高,mi R-378a-5p的表达显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:与正常人相比,SONFH患者的BMSCs中LINC-STXBP5-AS1表达明显升高,并且与mi R-378a-5p存在结构性匹配关系。第二部分:LINC-STXBP5-AS1通过mi R-378a-5p/Su Fu/Hedgehog信号通路轴调控地塞米松诱导BMSCs的凋亡方法:(1)利用10-6 mol/L地塞米松建立BMSCs凋亡模型,结合q RT-PCR技术,检测在地塞米松诱导BMSCs凋亡过程中LINC-STXBP5-AS1的动态表达。(2)构建sh-STXBP5-AS1的慢病毒载体,通过CCK-8检测、Hoechst 33342染色以及流式细胞仪分析,观察LINC-STXBP5-AS1调控地塞米松诱导BMSCs凋亡的作用。(3)采用通路阻断实验,加入Hedgehog信号通路阻断剂环巴胺之后,通过流式细胞仪分析,观察Hedgehog信号通路在LINC-STXBP5-AS1调控地塞米松诱导BMSCs凋亡过程中的作用。(4)利用细胞转染技术,构建sh-STXBP5-AS1的慢病毒载体,分别低表达mi R-378a-5p和过表达Su Fu之后,通过Western Blot分析,观察mi R-378a-5p和Su Fu在LINC-STXBP5-AS1调节Hedgehog信号通路以及调控地塞米松诱导BMSCs凋亡过程中的作用。结果:(1)qRT-PCR结果,在10-6mol/L地塞米松处理后,BMSCs的LINC-STXBP5-AS1表达水平升高(P<0.05),同时伴有细胞凋亡的发生。(2)CCK-8分析显示,LINC-STXBP5-AS1低表达能够显著对抗10-6 mol/L地塞米松对BMSCs增殖的抑制作用,但是未给予地塞米松处理时,LINC-STXBP5-AS1并不影响BMSCs的增殖。此外,Hoechst 33342染色与流式细胞仪分析显示,sh-STXBP5-AS1能够显著对抗10-6 mol/L地塞米松诱导的BMSCs凋亡。(3)在对抗地塞米松诱导的BMSCs凋亡过程中,sh-STXBP5-AS1可显著降低Su Fu水平(P<0.05)来激活Hedgehog信号通路,从而减少Cleaved Caspase-3的比例,抑制BMSCs凋亡。该通路的阻断剂环巴胺可明显增加凋亡细胞比例,减弱sh-STXBP5-AS1的抗凋亡作用。(4)分别下调mi R-378a-5p和上调Su Fu的表达均可逆转sh-STXBP5-AS1对Hedgehog信号通路的激活作用。结论:LINC-STXBP5-AS1可通过mi R-378a-5p/Su Fu/Hedgehog信号通路轴调控地塞米松诱导BMSCs的凋亡,但并不影响BMSCs的增殖。第三部分LINC-STXBP5-AS1与mi R-378a-5p,mi R-378a-5p与Su Fu的靶向关系验证方法:(1)观察BMSCs中LINC-STXBP5-AS1与mi R-378a-5p的相互调节作用:利用sh-STXBP5-AS1慢病毒转染细胞,观察BMSCs中mi R-378a-5p表达水平的变化;(2)构建双荧光素酶报告基因系统,LINC-STXBP5-AS1与mi R-378a-5p,mi R-378a-5p与Su Fu进行结构匹配性验证,明确LINC-STXBP5-AS1与mi R-378a-5p,mi R-378a-5p与Su Fu靶向结合的位点。结果:(1)给予sh-STXBP5-AS1转染BMSCs,观察mi R-378a-5p的表达水平明显升高(P<0.05)。以上结果表明,LINC-STXBP5-AS1与mi R-378a-5p之间存在相互调节的作用,且两者的表达水平呈负相关。(2)双荧光素酶报告基因系统分析显示,与其它组别相比,mi R-378a-5p mimics转染组的相对荧光值显著降低(P<0.05),提示LINC-STXBP5-AS1与mi R-378a-5p,mi R-378a-5p与Su Fu间存在靶向结合。结论:BMSCs中的LINC-STXBP5-AS1与mi R-378a-5p之间存在相互调节作用,且两者的表达水平呈负相关。此外,LINC-STXBP5-AS1与mi R-378a-5p,mi R-378a-5p与Su Fu具有靶向结合的位点。