论文部分内容阅读
目的 探讨微小RNA-365（miR-365）和E74样受体4（ELF4）在宫颈癌中的表达、作用和临床意义,验证miR-365直接靶向调控转录因子ELF4基因的表达,分析宫颈癌患者组织中miR-365和ELF4mRNA的表达与临床病理特征的关系。方法 选取2014年7月至2017年1月在唐山工人医院行宫颈活检及手术治疗的病例,临床资料完整,且术前并未接受过放化疗的病例,共135例,其中行全子宫切除的良性病变正常宫颈34例,宫颈上皮内瘤变（CIN）68例（其中CINⅠ31例、CINⅡ-Ⅲ37例）,术后病理回报为宫颈鳞癌33例,严格按照标本的纳入及排除标准,所取标本均经本院病理科主任医师证实。采用实时定量PCR（RT-qPCR）方法检测miR-365在正常宫颈组织（n=34）、宫颈上皮内瘤变Ⅰ级（CINⅠ）（n=31）、宫颈上皮内瘤变Ⅱ-Ⅲ级（CINⅡ-Ⅲ）（n=37）和宫颈鳞癌组织（SCC）（n=33）以及三种宫颈癌细胞系（C33A细胞、HeLa细胞、SiHa细胞）中的表达;生物信息学预测和荧光素酶报告基因检测验证miR-365与ELF4的3’UTR区域存在相互作用,初步分析miR-365与ELF4的靶向调节关系;采用Western blot方法检测ELF4在宫颈癌细胞中的表达情况;采用免疫组织化学方法检测不同病理宫颈组织中ELF4的表达变化;CCK-8实验检测在不同时间点下过表达或抑制miR-365对三种宫颈癌细胞株增殖的影响;在不同宫颈组织中miR-365与ELF4 mRNA表达进行相关性分析,将miR-365及ELF4 mRNA在宫颈鳞癌中表达情况分为低表达组及高表达组,并与临床病理参数进行比较。结果 1采用RT-qPCR实验检测不同病理人宫颈组织及不同宫颈细胞中miR-365表达水平,结果显示,与正常宫颈组织比较,在人宫颈癌组织中miR-365的表达水平降低（0.75 vs 1.31,t=3.802,P=0.001）;同样在体外培养细胞中,与正常宫颈上皮细胞HcerEpic比较,在三种宫颈癌细胞（C33A细胞、HeLa细胞、SiHa细胞）中miR-365的表达均明显下调,差异有统计学意义(SiHat=28.579,SiHaP=0.001;C33At=8.351,C33AP=0.013;HeLat=6.435,HeLaP=0.026)。2生物信息学预测显示在ELF4的3’UTR上存在miR-365结合的种子序列;进一步荧光素酶报告基因实验证实,过表达野生型miR-365,ELF4荧光素酶活性明显降低（t=2.896,P=0.028）,而过表达突变型miR-365,这种抑制作用消失（t=0.089,P=0.272）,结果说明miR-365与ELF4之间存在负向靶向调节关系。3 Western blot方法检测ELF4在宫颈癌细胞中的表达情况,结果显示,与正常宫颈上皮细胞比较,在三种宫颈癌细胞中ELF4的蛋白表达水平均增高,差异有统计学意义（at=8.821,aP=0.013;bt=22.327,bP=0.002;ct=6.985,cP=0.004）。4免疫组织化学检测在不同人宫颈组织中ELF4的表达情况,ELF4作为核蛋白发挥转录功能时免疫组化染色可见细胞核呈棕黄色颗粒,在正常组（Normal）、CINⅠ组、CINⅡ-Ⅲ组及SCC组的阳性染色面积百分比分别为（10.03±3.05）%、（20.12±2.88）%、（71.20±3.43）%、（81.23±9.02）%,表达逐渐增强,且宫颈癌组（SCC）阳性染色面积明显高于正常对照组（Normal）,差异有统计学意义（at=0.732,a P=0.575;bt=22.328,bP=0.002;ct=32.232,cP=0.001）。5 CCK-8验证miR-365在宫颈癌细胞株中的增殖作用,结果显示,在三种宫颈癌细胞中,与转染NC mimic组比较,miR-365mimic组的OD450值在48 h、72 h和96 h均降低（均P<0.05）;相反,与转染NC inhibitor组比较,miR-365 inhibitor组三种细胞株的OD450值在48 h、72 h和96 h均升高（均P<0.05）,提示miR-365具有抑制肿瘤增殖作用。6相关性分析结果表明,在Normal组和CINⅠ组,miR-365与ELF4 mRNA表达无相关性（r=0.227,P=0.285;r=-0.073,P=0.752）,而在CINⅡ-Ⅲ组及宫颈癌组（SCC）,两者间表达呈负相关（rA=-0.351,PA=0.045;rB=-0.349,PB=0.035）,同时,进一步临床病理参数分析表明,miR-365和ELF4mRNA的表达水平均与肿瘤大小、肿瘤病理分级及临床分期相关。结论 1 miR-365在人宫颈癌组织及细胞中表达下调,ELF4表达上调;2 miR-365负靶向调节下游转录因子ELF4;3 miR-365解除对下游靶分子ELF4的抑制作用,从而促进宫颈癌细胞的增殖和肿瘤的形成;4 miR-365和ELF4mRNA的表达均与肿瘤大小、肿瘤病理分级及临床分期相关。图6幅;表12个;参151篇。