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一、实验部分目的1.初步探讨骨髓间充质干细胞(BMSC)体外对再生障碍性贫血(AA)患者外周血T细胞增殖的影响及其相关机制；2.阐明BMSC对AA患者外周血中CD4+CD25+FoxP3+调节性T细胞(Treg)产生的影响及其相关机制。方法1.体外富集、纯化AA患者外周血中的T细胞,经CFDA SE荧光染色后与体外扩增的健康供者BMSC行共培养,分为直接接触组和Transwell组,共培养体系中加入PHA刺激T细胞增殖,同时设阴性及阳性对照组,于共培养72h后流式细胞仪检测各组T细胞的增殖情况；2.体外富集、纯化AA患者外周血中T细胞,与体外扩增的健康供者BMSC行共培养,分为直接接触组和Transwell组,流式细胞仪检测共培养前、共培养72h后CD4+CD25+FoxP3+Treg比例；3.qRT-PCR法检测共培养前后各组FoxP3mRNA表达量的变化；4.ELISA法检测共培养前BMSC培养上清中IL-10及TGF-β1的含量；5.在Transwell共培养体系中分别加入不同浓度(1ng/ml, 2ng/ml,4ng/ml)的rhIL-10,72h后流式细胞仪检测各组CD4+CD25+FoxP3+Treg比例变化,评价IL-10在调控CD4+CD25+FoxP3+Treg生成中的作用；6.在Transwell共培养体系中分别加入不同浓度(0.025ng/ml,0.05ng/ml, 0.1ng/ml)的rhTGF-β1,72h后流式细胞仪检测各组CD4+CD25+FoxP3+Treg比例变化,评价TGF-β1在调控CD4+CD25+FoxP3+Treg生成中的作用。结果1.CFDA SE染色分析显示,阳性对照组增殖T细胞百分率为57.25±3.50%,直接接触组增殖T细胞百分率为12.56±1.49%,较阳性对照组明显减低(P<0.01); Transwell组增殖T细胞百分率为47.75±3.65%,亦较阳性对照组减低(P<0.05)；直接接触组增殖T细胞与Transwell组相比明显减低(P<0.01)；2.流式细胞分析显示,与BMSC共培养后,直接接触组CD4+CD25+FoxP3+Tregt(?)例较前明显升高(P<0.01); Transwell组CD4+CD25+FoxP3+Treg亦较前升高(P<0.05)；3. qRT-PCR结果显示,共培养后直接接触组FoxP3mRNA相对表达量为9.14±0.89,Transwell组FoxP3mRNA相对表达量为6.03±0.91,均较共培养前(1)升高；直接接触组FoxP3mRNA相对表达量较Transwell组高；4. ELISA结果显示共培养前BMSC上清中IL-10浓度为1038.94±245.23pg/ml;TGF-β1浓度为1.57±0.32ng/ml;5.加入2ng/ml及4ng/ml外源性rhIL-10,共培养72h后CD4+CD25+FoxP3+Treg比例较共培养前升高(P<0.05)；且CD4+CD25+FoxP3+Treg比例随加入rhIL-10浓度的增高而增高(P=0.022,r=0.741)；6.加入0.1ng/ml外源性rhTGF-β1,共培养72h后CD4+CD25+FoxP3+Treg比例较共培养前升高(P<0.05)；且CD4+CD25+FoxP3+Treg比例随加入rhTGF-β1浓度的增高而增高(P=0.041,r=0.686)结论1.BMSC可通过与T细胞直接接触及分泌细胞因子的方式抑制AA患者异常增殖的T细胞,直接接触方式在其中发挥主要作用；2. BMSC可通过与T细胞直接接触及分泌细胞因子方式上调AA患者CD4+CD25+FoxP3+Treg的生成比例,直接接触方式在其中发挥主要作用；3. BMSC可分泌细胞因子IL-10及TGF-β1,这两种因子可能通过旁分泌机制上调CD4+CD25+FoxP3+Treg的生成比例。二、临床部分目的1.检测临床AA患者外周血中CD4+CD25+FoxP3+Treg比例变化情况,评价AA患者的免疫异常；2.观察异体BMSC治疗对AA患者外周血中CD4+CD25+FoxP3+Treg比例的影响；3.评价BMSC应用于AA治疗的疗效及安全性。方法1.流式细胞仪检测15例重型再生障碍性贫血(SAA)及15例慢性再生障碍性贫血(CAA)患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+Treg比例,并与15例健康者对照。2.按非随机对照方法,将26例AA患者分为BMSC治疗组(13例)及对照组(13例)。对照组患者采用传统IST治疗,BMSC治疗组在传统IST治疗的基础上加用BMSC治疗。分别于治疗前、后检测两组患者外周血中CD4+CD25+FoxP3+Treg比例变化。2.对上述两组患者进行疗效评估,评价BMSC治疗AA的疗效。3.行BMSC治疗的患者回输过程中监测生命体征,观察输注反应,并于治疗前后抽血检测肝功能、肾功能相关指标,评价BMSC治疗的安全性。结果1.流式细胞分析显示,健康对照者外周血中CD4+CD25+Foxp3+Treg比例为2.43±0.85%,SAA患者外周血中CD4+CD25+FoxP3+Treg比例为0.34±0.27%,显著低于健康对照者(P<0.01),CAA患者外周血中CD4+CD25+FoxP3+Treg比例为0.86±0.63%,亦较健康对照者减低(P<0.05)；2.BMSC治疗组治疗后外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg比例较治疗前升高(P<0.05)；其中CAA组患者CD4+CD25+Foxp3+Treg比例升高更明显(P<0.01)；对照组治疗后CD4+CD25+Foxp3+Treg比例无明显变化(P>0.05)；3.BMSC治疗组总有效率为84.62%,对照组总有效率为61.54%,BMSC治疗提高了AA治疗的有效率。但可能因为目前例数有限,两组疗效尚未达到统计学差异(P>0.05)；4.BMSC回输过程中生命体征平稳,无明显输注反应发生,输注后肝功能、肾功能指标无明显变化(P>0.05)结论1.AA患者存在外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg比例减低,其比例异常可能参与了AA的发病；2. CD4+CD25+Foxp3+Treg比例在SAA患者外周血中更低,提示其比例可能可以作为判断AA病情轻重的指标之一；3. BMSC治疗可上调AA患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+Treg比例,为BMSC纠正AA患者的免疫异常提供了临床依据；4.目前初步结果认为BMSC治疗与传统IST治疗疗效相当,但可提高AA患者的总有效率5. BMSC用于AA治疗安全性好。三、中医临床部分目的初步探讨AA不同中医症型患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+Treg比例是否有差别。方法1.将第二部分中纳入的30例AA患者按中医主症不同分为肝肾阴虚型、脾肾阳虚型、肾阴阳俱虚型及急劳温热型；2.流式细胞仪检测各症型外周血中的CD4+CD25+Foxp3+Treg比例。结果AA患者各中医症型间外周血中CD4+CD25+Foxp3+Treg比例无统计学差异(P>0.05)。结论外周血中CD4+CD25+Foxp3+Treg比例对AA患者中医症型分型无明显提示价值。