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在糖尿病肾病发病的多种机制中,内质网应激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)被证实与糖尿病肾病关系密切,是糖尿病脏器实质细胞损伤早期反应的共性机制,受到广泛重视。在内质网应激的三条通路中,未折叠蛋白反应(Unfloded protein reaction,UPR)是最主要的ERS保护途径。目前对UPR的研究最为深入,机制也相对确切。存在于内质网膜上的三个重要的内质网应激蛋白：分别是双链RNA依赖的蛋白激酶样激酶(PERK),Ⅰ型跨膜蛋白激酶/核糖核酸内切酶(IRE1),激活转录因子6(ATF6)。它们可以使应激的信号有效地扩增和放大,使内质网应激启动。正常情况下,PERK、ATF6和IRE1与葡萄糖调节蛋白78(glucose regulating protein78,GRP78)形成一种无活性复合物,当细胞内存在大量游离未折叠蛋白,原本与PERK结合的GRP78便解离出来与未折叠蛋白结合,从而使PERK被暴露出来,发生磷酸化而被激活,将引起真核翻译起始因子2α(eif2α蛋白)磷酸化,从而减少蛋白质的新合成及运输,有效缓解内质网腔中蛋白的过载。与此同时,磷酸化的eif2α可特异性地上调转录活性因子-4(ATF4)的表达。ATF4表达的增加可诱导细胞凋亡相关因子CHOP的表达,使过度损伤的细胞进入凋亡程序,从而降低了细胞蛋白质的负载,故PERK的激活和eif2α的磷酸化可以被认为是内质网应激发生的标志。中药在针对糖尿病肾病的治疗上得到越来越多的认可,本实验从内质网应激的角度着手,深入探讨黄芪注射液联合葛根素注射液共同治疗糖尿病肾病的机制。研究目的：通过观察KKAy糖尿病小鼠肾脏和人肾小管上皮细胞中内质网应激相关因子GRP78、 PERK、eif2α表达的改变,以及形态学和血液生化的改变,探索黄芪注射液和葛根素注射液对KKAy小鼠DN肾损伤的干预效应,揭示黄芪和葛根配伍通过调节内质网应激反应防治DN的具体作用机制,为黄芪和葛根配伍治疗DN提供实验依据,为糖尿病肾病临床用药提供新的靶点。研究方法：1、整体实验(1)选取随机血糖≥13.9mmol/L的KKAy小鼠作为受试对象,将KKAy小鼠分为模型组和治疗组,治疗组给予黄芪注射液(0.03ml/10g.d)联合葛根素注射液(0.013ml/10g.d)腹腔注射治疗。对照组为同龄C57BL/6J雄性小鼠。从小鼠12周开始,对治疗组进行腹腔注射给药,模型组给予同等剂量生理盐水注射。持续4周后,于16周龄处死各组小鼠,取血清检测空腹血糖、尿素、肌酐、甘油三酯,胆固醇。(2)小鼠于16周龄被处死,切取肾脏组织,制作组织切片进行HE染色,光镜下观察肾组织病理形态。制作电镜标本,透射电镜观察肾组织超微结构。(3)用免疫组化方法,检测各组小鼠肾组织中GRP78蛋白的表达。(4)运用Real-time PCR方法,检测PERK、eif2α和GRP78mRNA在各组小鼠肾组织中的表达。(5)用western-blot方法,检测各组小鼠肾组织中PERK、eif2α、GRP78蛋白的表达。2、离体实验(1)实验分组：人肾小管上皮细胞(HK-2)置于5%CO2,恒湿,37℃条件下培养,至80%融合后胰酶消化传代,传代后无血清培养基培养24h,按以下要求分组：模型组：高糖培养基(葡萄糖浓度为25mmol/L)培养细胞；治疗组：高糖培养基(25mmol/L)+黄芪注射液(8mg/ml)+葛根素注射液(0.08mg/ml),共培养。对照组：普通培养基(葡萄糖浓度为5.5mmol/L)培养细胞。(2)培养48h后,消化取材,用Real-time PCR方法,检测PERK、eif2α和GRP78mRNA在各组肾小管上皮细胞中的表达。(3)培养48h后,消化取材,用western-blot方法,检测各组肾小管上皮细胞中PERK、 eif2α、GRP78蛋白的表达。研究结果：1、整体实验(1)小鼠血液生化指标检测显示,与对照组小鼠比较,模型组小鼠空腹血糖、肌酐、尿素、甘油三酯、胆固醇、均显著升高；经过黄芪注射液、葛根素注射液联合用药后,治疗组空腹血糖、尿素、胆固醇较模型组均显著降低。(2)小鼠肾组织石蜡切片HE染色光镜观察可见对照组小鼠肾脏肾小管、肾小球结构完整清晰,无间质纤维化；16周龄KKAy模型组小鼠可见系膜基质轻微增多,偶可见空泡出现于肾小管上皮细胞胞浆,部分视野可见轻微肾小管萎缩等糖尿病肾病早期病变,整体病变较轻。经治疗后,肾小球、肾小管结构完整,清楚,偶可见少量空泡,病变不明显。透射电镜观察可见对照组小鼠肾小球结构完好,足突排列有序,基底膜清楚完整,肾小管上皮细胞线粒体结构正常。而模型组小鼠肾小球基底膜轻度增厚,肾小球系膜基质增多,肾小管上皮细胞胞浆疏松,内质网及细胞核肿胀,线粒体肿胀、嵴消失,足突排列紊乱、融合；与同周龄模型组小鼠相比,治疗组小鼠肾小球毛细血管基底膜轻度增厚,肾小球系膜区基质轻度增多,肾小管上皮细胞线粒体、内质网轻度肿胀。(3)免疫组化观察可见模型组小鼠肾脏GRP78蛋白表达丰富,模型组GRP78蛋白表达量明显高于对照组,治疗组较对照组GRP78无明显差异,但较模型组明显降低。(4) Real-time PCR检测结果显示：在16周龄时,PERK、eif2α、GRP78三个目的因子的mRNA在模型组KKAy小鼠肾组织的表达量与对照组相比明显升高,治疗组与模型组相比明显降低。(4) Western blot结果可见模型组eif2α、 GRP78和PERK蛋白表达高于对照组和治疗组,治疗组和对照组之间无明显差异。2、离体实验(1)人肾小管上皮细胞PERK、eif2α和GRP78mRNA在模型组的表达量与对照组相比明显升高,治疗组较模型组明显降低。(2)模型组eif2α、GRP78蛋白表达高于对照组和治疗组,治疗组和对照组之间无明显差异；PERK蛋白在各组之间的表达无明显差异。结论：(1)黄芪注射液与葛根素注射液合用,有降低血糖、血脂,保护肾功能的作用。(2)16周龄时,KKAy小鼠有肾脏功能损害,内质网应激相关因子的基因和蛋白的高表达证明ERS被激活,且内质网应激是糖尿病肾病病情发展的重要环节。黄芪注射液与葛根素注射液合用可通过对PERK、eif2α、GRP78等内质网应激相关因子mRNA和蛋白的表达的调整发挥治疗糖尿病肾病的作用。(3)高糖可诱导人肾小管上皮细胞发生内质网应激反应,黄芪和葛根素注射液对治疗组的症状缓解作用明显,可能通过影响未折叠蛋白反应而保护肾小管上皮细胞,从而治疗糖尿病肾损伤。