论文部分内容阅读
雌激素作为一种广泛存在于人类及其他高等动物体内的性类固醇激素,具有十分重要的生理功能,主要参与生殖系统发育、骨骼形成、脂肪代谢及中枢神经系统形成等生理活动。雌激素功能的发挥,主要通过雌激素受体(ERs)来介导,因此对ERs在卵黄发生中的作用进行研究,有助于更好的了解雌激素信号通路。本文以金钱鱼为研究对象,利用同源克隆法,克隆获得金钱鱼ERs三个亚型(ERα、ERβ1和ERβ2)的cDNA全长以及卵黄蛋白原基因(Vtgs)三个亚型(VtgA、Vtg-B和Vtg-C)的cDNA片段,通过半定量PCR(SqRT-PCR)检测ERs的组织分布及卵黄发育不同时期肝脏中ERs的表达;应用实时荧光定量PCR(qPCR)检测了雌二醇(E2)、雌激素受体拮抗剂(ICI182780、MPP和Cyclofenil)对雄鱼肝脏中ERs和Vtgs mRNA表达的影响;利用酶联免疫吸附(ELISA)法测定了E2及雌激素受体拮抗剂处理后VTG蛋白的含量变化。主要实验结果如下:1.金钱鱼雌激素受体基因克隆及序列分析金钱鱼ERs基因有三种亚型:ERα的cDNA全长为1876 bp,开放阅读框(ORF)为1770bp,编码589个氨基酸残基;ERβ1的cDNA全长为1811 bp,ORF为1683bp,编码560个氨基酸残基;ERβ2的cDNA全长为2111 bp,ORF为1974bp,编码657个氨基酸残基。氨基酸序列分析表明,金钱鱼雌激素受体均含有核受体典型的功能域,属于核受体家族成员。2.金钱鱼雌激素受体基因的时空表达模式在所检测的金钱鱼11种组织(脑、垂体、精巢、卵巢、肝脏、肾脏、脾、肠、心、鳃和肌肉)中,ERα主要在雌、雄鱼的性腺、脾脏、心脏、脑和垂体中高表达;ERβ1具有广泛的组织分布,仅雄鱼鳃、雌鱼脾脏和鳃中未见表达;ERβ2除在雌、雄鱼的性腺、脾脏、肠、脑、垂体、和心脏中表达外,在雄鱼的肾脏和雌鱼的肝脏、肌肉和鳃中也有表达。ERs在卵黄发生前和卵黄发生期金钱鱼肝脏中的分布结果显示,在卵黄发生前期ERα和ERβ1表达较弱,但卵黄发生期表达量增加;而ERβ2表达量两个时期无明显变化,提示ERα和ERβ1在雌激素刺激VTG生成过程中可能具有重要作用。3.雌二醇对雌激素受体及卵黄蛋白原表达的影响Vtgs基因三个亚型Vtg-A、Vtg-B和Vtg-C部分片段大小分别为1235bp、1089bp和1087bp。以不同剂量E2(0.1,1和10μM)离体孵育金钱鱼肝脏组织24小时后,发现中、高浓度的E2显著促进ERα、ERβ1及Vtgs mRNA的表达(P<0.05),VTG蛋白水平增加,暗示ERα和ERβ1共同参与卵黄蛋白的发生。4.雌激素受体拮抗剂对雌激素受体及卵黄蛋白原表达的影响雌激素受体广谱拮抗剂ICI182780(0.01、0.1和1μM)显著抑制雌激素诱导的雄性金钱鱼肝脏中ERs、Vtgs mRNA水平及VTG含量(P<0.05),且这种抑制效果大多具有剂量依存关系,说明在金钱鱼卵黄蛋白发生过程中,ERα和ERβ1共同调控Vtgs基因的表达,从而促进卵黄蛋白的形成。雌激素受体alpha型拮抗剂MPP抑制了雌激素诱导的雄性金钱鱼肝脏中ERα、Vtg-B、Vtg-C mRNA表达水平及VTG含量,但促进ERβ1和Vtg-A mRNA表达;而雌激素受体beta型拮抗剂Cyclofenil抑制雌激素诱导的雄性金钱鱼肝脏中ERβ1、ERβ2、Vtg-A、Vtg-C mRNA表达水平及VTG含量,但促进ERα和Vtg-B mRNA表达。结果暗示ERα主要调控Vtg-B mRNA的表达而ERβ1主要调控Vtg-A mRNA的表达。当ERα介导的信号通路出现阻断时,将会引起ERβ1和Vtg-A mRNA表达量上升;而ERβ1介导的信号通路被阻断时,ERα和Vtg-B mRNA表达水平上升。