L-苏氨酸醛缩酶的固定化及其应用

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β-羟基-α-氨基酸是重要的医药中间体,具有两个手性中心。L-苏氨酸醛缩酶(L-TA)是磷酸吡哆醛(PLP)依赖性酶,可以从甘氨酸和醛出发一步合成β-羟基-α-氨基酸,具有极大的工业化潜力。但游离酶难以重复利用,后续与产物分离困难,严重阻碍了工业应用。本文以L-TA(来源于Bacillus nealsonii)催化甘氨酸和对甲砜基苯甲醛合成L-syn-对甲砜基苯丝氨酸(L-syn-MTPS)为模型反应,筛选确定了最佳固定化方法;通过优化固定化条件,提高了固定化酶的酶活回收率和蛋白回收率;建立了树脂重复利用的方案,降低了固定化成本;研究了催化合成对甲砜基苯丝氨酸的工艺,确定了最佳反应器及条件。具体内容如下:(1)以酶活回收率,蛋白回收率和操作稳定性为标准,对不同的固定化方法进行了研究。确定了两种较好的固定化方案:1)经戊二醛活化后的氨基树脂NAA共价结合L-TA,酶活回收率达到53.3%,使用80h后,酶活为初始酶活的74.9%。2)经戊二醛活化后的氨基树脂HA共价结合L-TA,酶活回收率为52.2%,使用80h后,酶活为初始酶活的70.1%。(2)优化了 NAA和HA的固定化条件。比较优化后两种固定化酶的酶活回收率和蛋白回收率,选择NAA为最佳固定化载体。在游离酶/载体为21.8 U/g,戊二醛浓度为0.4%,树脂活化时间为1 h,固定化时间,温度,pH分别为5 h,35℃,8.0的条件下,酶活回收率达到89.6%,酶活为19.6U/gcarrier。固定化酶在30℃下的半衰期为59天,相比游离酶提高了 6.5倍。将其用于催化合成对甲砜基苯丝氨酸,第一批产率为62.2%,经过460 h,产率依旧维持在57%以上,酶活残余79.2%,优于目前文献报道的研究结果。(3)建立了氨基树脂再利用的方法。该方法将失活固定化酶表面的氨基用戊二醛活化后,再与新的游离酶结合,从而实现固定化酶失活后树脂的再利用。利用该方法将树脂重复利用两次。第一次再利用废树脂固定化酶,酶活回收率和蛋白回收率分别为81.2%和91.2%,第二次再利用废树脂固定化酶,酶活回收率和蛋白回收率分别为80.2%和90.5%。考察了两次利用废树脂固定化得到的固定化酶的操作稳定性,经过460 h,产率均维持在57%以上,说明再利用废树脂和新树脂性能相当,大大降低了固定化成本。这也是该方法首次被应用于氨基树脂的再利用中。(4)对L-syn-MTPS的催化合成工艺进行了研究。通过对比流化床,旋转床和搅拌釜反应器中酶催化过程,确定最佳反应器为搅拌釜。对比水溶液和不同浓度的DMF中固定化酶酶活,催化过程和半衰期,最终确定水为最佳反应介质,并优化确定甘氨酸浓度为1 mol/L。在此条件下,放大到20L反应器,固定化酶连续催化12个批次,催化性能稳定。
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