葡萄白藜芦醇合酶基因的克隆及转基因番茄、酵母表达系统的建立

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白藜芦醇(Resveratrol,简称Res)是一种植物抗毒素,具有抗菌、抗氧化、抗血小板凝集、保护心血管、抗癌等多种保健作用。最新研究还表明,Res可使脊椎动物非洲齿鲤的寿命延长60%,并使其神经细胞衰老减慢,这一结果意味着白藜芦醇很可能让包括人类在内的其他脊椎动物的寿命延长。然而,在自然的条件下,Res在植物体内的含量非常低,要用传统的提取方法得到高丰度的Res非常困难,并且成本较高。白藜芦醇合酶(Resveratrolsynthase,简称RS)是Res合成途径中最后一个起作用的关键酶,本实验通过分子生物学手段,得到白藜芦醇合酶基因,并分别建立了其植物和毕赤酵母表达系统,以期望得到稳定的、高丰度的白藜芦醇,目前已取得了如下进展: 利用PCR的方法从葡萄基因组中得到RS基因,并构建克隆载体pBS-T/RS,测序结果与NCBI上登陆号S63221的核苷酸序列比对,同源性达到98%;与登陆号为DQ459351.1的核苷酸序列比对,同源性达到99%。与登陆号ABE68894.1的氨基酸序列比对,同源性达到98%,葡萄RS基因全长1179bp,编码392个氨基酸,证明RS基因成功克隆至pBS-T载体中。 利用酶切、连接等方法将RS基因插入到植物表达载体pBI121的CaMV35S启动子和NOS终止子之间,成功构建植物表达载体pBI121/RS,冻融法转入农杆菌LBA4404。利用农杆菌介导的叶盘法转化番茄并初步建立转基因番茄的再生体系,HPLC法测定显示转化番茄中已产生Res。 成功构建含有AOX1强效启动子、HIS4筛选基因的酵母表达载体pPIC3.5K/RS。并用电激法将该载体整合进毕赤酵母基因组中,发酵实验及SDS-PAGE分析表明目的蛋白已表达。
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