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目的:观察腺病毒介导的血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)基因转染在大鼠脑缺血再灌注损伤中的作用;探讨调节血红素加氧酶基因表达对临床脑卒中的治疗前景。方法:建立携带血红素加氧酶-1基因的腺病毒载体:取大鼠脾脏细胞提取总RNA,参考GerieBank公布的大鼠HO-1序列(J02722)设计上下游引物,采用反转录-聚合酶链反应扩增HO-1基因;采用AdEasy System方法构建包含HO-1基因的重组腺病毒载体(Ad-HO-1)。测得Ad-HO-1和空载体腺病毒(Ad-GFP)滴度分别为2.5×1011PFU/ml、2.0×1011PFU/ml。健康雄性SD大鼠72只随机分为4组:假手术对照组(sham group,SH)、生理盐水组(vehicle group,V)、空载体组(adenovirus group,Ad)和Ad-HO-1转染组(HO group),各组18只。后3组在缺血前3d于大鼠右侧脑室分别注射20μl生理盐水、20μl生理盐水含空载体腺病毒(1.0×1010 Plaque-forming unit/ml,PFU/ml)和重组HO-1腺病毒(1.0×1010PFU/ml)1μl,注射方法部位参照Paxinos和Watson的大鼠脑立体定位图谱。连续注射3d后,参照zea—Longa线栓法建立大鼠大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)缺血再灌注模型,大鼠予以2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉,术中麻醉机控制持续吸入2%异氟烷,用线栓阻断右侧MCA的血液供应,阻断大脑中动脉2h后退出线栓,给予再灌注。术中以手术恒温设备将直肠温度控制在36.5-37.5℃,以探针监测大鼠颞温,多普勒探针检测脑缺血局部血流。每组大鼠在缺血再灌注后24小时测定Garcia神经功能评分,然后处死大鼠并取全脑标本,行脑切片采用TTC染色法测定大脑梗死体积,并计算梗死体积百分比。于脑缺血再灌注2h后取脑组织匀浆检测细胞凋亡指标Caspase-3活性;于再灌注2h后取脑切片行TUNEL染色检测细胞凋亡率。在荧光显微镜下观察连续转染后24h时脑组织荧光蛋白的表达情况,并计算转染率。Western blot检测转染后24h脑组织HO-1的表达。结果:转染后HO-1表达的变化:Western blot检测示:HO组大鼠脑内HO-1表达显著高于Ad组和V组,Ad组和V组比较HO-1表达无明显差异。绿色荧光蛋白示转染率:显微镜下观察Ad组和HO组的大鼠脑切片,均可见有绿色荧光蛋白表达且两组比较绿色荧光蛋白表达量无明显差异,并测定转染率为(34.5±3.4)%。神经功能评分:在脑缺血再灌注后24h, SH、V、Ad、HO四组大鼠的神经功能评分分别为18、9.571±0.254、9.857±0.149、12.75±0.211,HO组大鼠神经功能评分均显著优于Ad组和V组,差异有统计学意义(P<0:001);Ad组与V组比较神经功能评分无明显差异。梗死体积及细胞凋亡的检测:a.脑梗死体积:在脑缺血再灌注后24h, SH、V、Ad、HO四组大鼠的脑梗死体积百分比分别为0%、60.36±6.750%、61.80±7.544%、27.31±2.913%,与SH组比较,V组、Ad组脑梗死体积百分比显著增高;与V组及Ad组比较,HO组脑梗死体积百分比显著降低(P<0.01);Ad组与V组比较脑梗死体积百分比无显著差异。b.神经细胞凋亡:在脑缺血再灌注后2h, SH、V、Ad、HO各组中纹状体、海马(CA1区)、皮层(缺血半暗带)的凋亡细胞阳性率及Caspase-3活性分别为SH组:<0.1%/0.800±0.170、<0.1%/0.441±0.193、<0.10%/0.674±0.186。V组:(53.39±1.742)%/8.889±0.352、(34.81±1.206)%/7.750±0.446、(57.67±2.591)%/7.144±0.424。Ad组:(52.27±1.051)%/8.273±0.359、(36.31±2.210)%/8.284±0.264、(59.33±2.951)%/7.744±0.398。HO组:(43.83±1.15)%/6.217±0.313、(27.31±1.382)%/6.428±0.342、(48.94±2.12)%/6.472±0.347。与SH组比较,V组、Ad组神经细胞凋亡率及Caspase-3活性均显著增高;与V组及Ad组比较,HO组神经细胞凋亡率及Caspase-3活性均显著降低(P<0.01);Ad组与V组比较神经细胞凋亡率及Caspase-3活性均无明显差异。结论:通过AdEasy Sytem成功构建含有HO-1基因的腺病毒载体;通过zea—Longa线栓法建立稳定的MCAO模型;腺病毒携带的HO-1基因通过立体定向法脑室内转染能有效的转染脑组织,并在脑内稳定表达;Ad-HO-1对局灶性脑缺血再灌注大鼠脑组织有保护作用,其机制是外源性HO-1基因促使HO-1表达上调,高度表达的HO-1早期(2h)发挥抗凋亡作用并在晚期(24h)转化为具有临床意义的减少梗死的作用。