第一部分异位骨化动物模型的建立与评价目的:比较兔股骨近端扩髓手术后,覆盖扩髓口肌瓣组织内注入骨髓组织和保持此类肌瓣血供两种因素引起髋关节周围异位骨化的作用。验证两因素同时施加的手术建模方法,其诱导异位骨形成的过程是否具有更好的可重复性和稳定性。方法:选取40只4月龄健康成年雄性新西兰大白兔,随机分为4组,每组10只,分批手术。A组(单纯扩髓手术组)、B组(肌瓣创面覆盖扩髓口组)、C组(骨髓组织注入无血供肌肉创面覆盖扩髓口组)、D组(骨髓组织组注入肌瓣创面覆盖扩髓口组)。比较4种不同建模手术方式造成的异位骨化的术后不同时间点的影像学、血清学变化以及异位骨组织形成过程的组织结构变化,分别于术后4周、8周、12周,每组取6只实验动物摄X线骨盆正位片判断Brooker分级,比较各组Brooker分级2级以上诱发率、分级结果总体分布、组间比较有无差异;每组取2只实验动物取异位骨组织进行脱钙后HE染色组织学检查和透射电镜观察;每组取6只实验动物检测血清碱性磷酸酶活性,进行动态变化的统计描述。结果:(1)4组术后3个时间点X线Brooker分级2级以上总诱发率和分级水平,有随时间延长而增加的趋势。骨髓注入的实验组的Brooker分级2级以上诱发率在术后三个时间点上,均强于未注入骨髓的实验组,有统计学差异。保持肌肉组织血供的实验组Brooker分级2级以上诱发率在术后三个时间点上,均强于未保持肌肉组织血供的实验组,但无统计学差异。(2)4种手术建模方式引起的异位骨化严重程度在三个时间点上X线Brooker分级结果的组间比较,联合干预组D组均高于实验对照组A组,差异有统计学意义(A组vs D组:术后4周P=0.006;术后8周P＜0.001;术后12周P＜0.001)。(3)组织学结果显示,注入骨髓或保证血供的单一干预因素均能增加成骨早期异位骨化发生的严重程度水平,其中骨髓注入因素组异位骨化组织学过程连续性较保证血供因素组好。联合干预组异位骨化发生的程度在术后三个时间点上均重于实验对照组,且骨化的组织学过程连续进行,能够发展为成熟异位骨组织。(4)动态监测血清碱性磷酸酶水平的变化趋势,联合X线发现,有助于判断异位骨组织成骨活动是否持续。4组血清ALP水平均值在术后4周达到峰值,术后8周、12周逐渐下降。实验对照组A组下降最快,联合干预组D组下降最慢,术后12周D组血清ALP水平仍高于其他三组,提示D组的异位成骨活动在术后12周仍强于其他实验组。结论:本研究改进了兔双髋创伤后异位骨化动物模型,骨髓注入肌肉组织并保持良好肌肉血供两因素联合施加的手术方式,使得该模型在影像学、组织学、血清学三方面的检查结果更为稳定。骨髓注入因素的促异位成骨作用强于保持良好血供因素,后者在异位成骨过程早期与前者有协同作用。该模型异位骨形成的机制与临床常见机制相似,且手术操作容易实现,取材方便,使用临床常用的验证指标。第二部分骨组织总蛋白质提取方法的改进目的:通过优化骨组织总蛋白提取的方法,减少蛋白质的降解、丢失,保持总蛋白提取液中蛋白质浓度,特别是小分子量蛋白质,降低溶液中金属离子的浓度,建立符合蛋白质组学实验要求的骨组织总蛋白提取技术方法。方法:取成年新西兰大白兔股骨近端的正常骨组织及第一部分动物模型中获得的异位骨,通过对文献报道的基本研磨提取+透析+丙酮沉淀法的改进,对易提取部分的组织用传统方法,不易提取部分的组织加入低温脱钙、超声震荡等步骤进行再提取。对本实验采用的两种实验方法,进行Bradford法蛋白浓度测定、SDS-PAGE质谱兼容银染法进行比较。结果:优化的提取方法减少提取液中蛋白质的降解、丢失,加强对难溶组织中可溶性蛋白质的提取,透析和丙酮沉淀降低了溶液中金属离子的浓度,总蛋白提取液中蛋白质浓度增高,SDS-PAGE显示蛋白质条带更清晰,小分子量蛋白质条带增多。结论:优化的提取方法较传统方法,增加了骨组织总蛋白提取液的蛋白浓度,提高了SDS-PAGE和双向凝胶电泳的分辨率,特别是小分子量蛋白质条带。该技术获取的骨组织样品蛋白提取液兼容后续蛋白质组学的双向凝胶电泳实验方法,可用于差异表达蛋白的初筛。