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人呼吸道合胞病毒(Human respiratory syncytial virus,HRSV)是引起全球小于一岁婴幼儿急性下呼吸道感染最主要的病原体,同时RSV还可以感染器官移植以后的病人、免疫缺陷人群以及老年人,致死率极高。RSV是1956年在一只黑猩猩的鼻炎分泌液中首次发现的,一年后在患有呼吸道疾病感染的婴儿体内分离出同样的病毒。因该病毒可致使感染的细胞产生特殊的细胞间融合现象,故称之为“呼吸道合胞病毒”。RSV每年感染3千万左右的婴幼儿,其中对发展中国家的影响最大。在全世界范围内,迄今无疫苗或有效的药物来治疗其感染。因此急需研发有效的抗病毒药物和疫苗。环靶明(Cyclopamine,CPM)是一种异甾体类生物碱,对多种肿瘤都有良好的抑制作用。我们课题组前期的研究发现环靶明能够有效抑制呼吸道合胞病毒的复制,但其可影响Hedgehog信号通路的正常活性,具有致畸作用,这一特性妨碍了将其开发为治疗病毒感染的儿科用药。基于之前的研究,我们课题组在CPM结构的基础上进行了一系列的修饰,设计了 14种类似物,根据修饰位置和基团的不同分为4个系列,S1-1,S1-2,S1-3,S1-4为第一个系列,S1-5,S1-6,S1-7,S1-8为第二个系列,C2-2,C2-3,C2-4为第三个系列,S2-4,S2-5,S2-6为第四个系列,以上14种类似物我们称之为特定化合物库,并从中筛选具有特异性抑制RSV复制且对Hedgehog信号通路无显著抑制效果的一种有效类似物。为了筛选有效的类似物,我们建立了一种基于检测荧光素酶表达量的快速检测化合物抗病毒效果的方法,在RSV-Long毒株P蛋白和M蛋白基因之间插入firefly luciferase基因,从而用萤火虫荧光素酶的表达水平指示病毒的感染复制水平,间接评估化合物的抗病毒功能。为了评估化合物的副作用,即对Hedgehog通路活性的抑制,我们建立了双报告基因检测系统,来指示Smo介导的转录元件的发生活性。通过分析14种类似物的抗病毒效果,我们找到6种IC50<5μM的类似物:S1-1,S1-2,S1-3,S1-4,S2-4,S2-5,同时我们基于双报告基因检测的方法检测该6种类似物对Hedgehog信号通路的抑制效果,我们找到3种IC50>5μM的类似物:S1-2,S1-3,S2-5。通过抑制系数ICrh综合评估,我们筛选得到有效的类似物S2-5。在我们的实验中,CPM的抗病毒作用IC50为0.08μM,S2-5的抗病毒实验IC50为2.25μM,修饰后的有效类似物抗呼吸道合胞病毒IC50是CPM的28倍。CPM对Hedgehog信号通路生物活性影响的IC50为0.07μM,S2-5对Hedgehog信号通路生物活性影响的IC50大于20μM,修饰后有效类似物对Hedgehog信号通路生物活性IC50是CPM的285倍。经过修饰大大降低了化合物对Hedgehog信号通路的抑制作用,同时也有一定的抗RSV复制的水平。通过微基因组检测(minigenome assay)实验验证了 CPM及有效类似物S2-5均主要作用于M2-1蛋白的151位点,验证了 CPM与S2-5均抑制minigenome下游基因表达,并且M2-1151位点对两种化合物都有耐药性,间接证实了 CPM与S2-5具有相似的抗病毒分子机制,即均靶向M2-1蛋白。总之,我们设计并筛选到有效的抗呼吸道合胞病毒的类似物,同时减少其对Hedgehog信号通路的影响。我们的研究为进一步研究HRSV的复制机理提供理论基础,把CPM通过化学改造,将其开发为治疗HRSV感染的临床候选用药。