红细胞(red blood cell,RBC)是机体血液的主要组分,主要功能是运输氧气和二氧化碳。临床中,对于创伤或者术中大量出血的患者,输血是一种基本的治疗手段。临床中患者输注的红细胞多为储存红细胞,医院采用“先进先出”的原则为患者输血。红细胞储存过程中不可避免的发生一系列生理生化、形态结构及功能变化,如能量代谢障碍、氧化应激水平升高、细胞内p H下降、红细胞变形性及携氧能力下降等,这些统称为“储存损伤”。红细胞储存损伤可以导致红细胞回输不良反应。动物实验表明,相对于新鲜红细胞,储存时间为7天的红细胞变形性显著下降,回输后会加重失血性休克复苏后急性肝损伤。另外,回输红细胞的储存时间延长还会导致肺炎比格犬模型的死亡率增加。临床研究中,在创伤、危重症或围术期等患者中,储存红细胞输注与输血相关急性肺损伤、多器官功能障碍及感染率和死亡率增加等不良反应密切相关。尽管大量研究揭示红细胞储存损伤与红细胞回输不良反应密切相关,但是,储存红细胞回输不良反应的确切机制尚不明确。目前有一氧化氮(Nitric oxide,NO)活性丧失、能量耗竭、游离血红蛋白氧化损伤、变形性下降、铁超载等多种假说解释红细胞回输不良反应的发生。基于以上假说进行的研究发现,吸入NO、洗涤红细胞或复状液处理储存红细胞等方法可以缓解或减少储存红细胞回输不良反应的发生。然而,以上方法大多是在红细胞发生不可逆损伤以后的补救措施,如果在红细胞储存过程中,抑制红细胞储存损伤的发生,可能会获得更大的治疗益处。根据美国食品药品监督管理局(FDA)标准,红细胞经过体外储存后溶血率应小于1%,回输至受体24小时后红细胞的恢复率应大于75%。红细胞储存后溶血率、存活率及储存损伤与红细胞保存液成分密切相关。自1915年,Rous和Turner首次将枸橼酸和葡萄糖混合溶液用于红细胞体外储存以来,红细胞保存液的组成不断改进。目前,临床上4℃储存红细胞时间上限为42天,主要应用CPDA-1、氯化钠-腺膘呤-葡萄糖-甘露醇(SAGM)等红细胞保存液保存红细胞。研究发现,通过改进红细胞保存液的组成和理化性质可以改善储存红细胞能量代谢,减轻储存损伤,延长了红细胞的储存时间。在储存过程中,红细胞能量代谢发生障碍,添加能量代谢底物葡萄糖储存红细胞,可有效改善红细胞能量代谢,降低储存红细胞溶血率。储存过程中,红细胞内抗氧化能力下降,氧自由基会直接氧化细胞膜及胞中关键蛋白,造成不可逆的氧化损伤,而目前红细胞保存液中缺乏抗氧化成分。Stowell等发现,在红细胞储存过程中添加抗氧化剂维生素C储存红细胞,尽管可有效提高储存红细胞回输存活率,并且降低免疫原性,但是研究同时发现添加维生素C储存红细胞回输后并不能改善机体炎性反应。一直以来对红细胞储存损伤及其回输不良反应的研究从未停歇,但是红细胞在储存过程中发生的储存损伤仍未得到实质性改善,并导致红细胞回输不良反应的发生。因此,在红细胞储存过程中,添加物质可能改善红细胞储存损伤,降低回输不良反应。丙酮酸钠(sodium pyruvate,SP)是丙酮酸的钠盐。丙酮酸是糖代谢途径中的关键中间产物,既可进入三羧酸循环参与有氧代谢,生成二氧化碳、水,并产生能量,也可进行无氧酵解转变为乳酸,伴随产生能量。丙酮酸钠具有抗氧化、抗炎、保护器官和纠正酸中毒等作用。已有研究表明,使用添加丙酮酸钠的复状液对储存红细胞进行处理,发现能够增加储存红细胞ATP和2,3-DPG的水平,改善红细胞功能。然而,由于红细胞在储存过程中发生不可逆的储存损伤,因此在回输前采用含有丙酮酸钠成分的复状液处理红细胞不能完全逆转储存损伤。目前,在红细胞储存过程中添加丙酮酸钠对储存红细胞携氧能力、氧化应激水平等储存损伤及回输造成的不良反应的影响未见报道。我们推测,在红细胞储存过程中添加丙酮酸钠,可以有效改善红细胞储存损伤,减轻回输不良反应。小鼠储存红细胞回输模型是研究储存红细胞回输不良反应的常用动物模型。研究表明,储存14天的小鼠红细胞和储存42天的人类红细胞经历了相似的形态功能的变化,并且具有相似的生理生化状态。因此,本研究拟用储存14天的小鼠红细胞模拟人类储存红细胞,建立小鼠储存红细胞平台,研究丙酮酸钠对红细胞储存损伤的改善作用,并进一步探讨丙酮酸钠在减轻储存红细胞回输不良反应中的作用。第一部分小鼠体外储存红细胞平台的建立本研究拟探讨在红细胞储存过程中添加丙酮酸钠对储存红细胞氧化应激水平、携氧能力等储存损伤及回输不良反应的影响,首先需要建立小鼠体外储存红细胞平台。戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠(其注射量按75mg/kg体重计算),放于超净工作台中,用75%酒精消毒动物手术区域及手术器械,同时机械通气,通过心脏穿刺取血,CPDA-1作为抗凝剂和储存液,终浓度为14%,用白细胞滤器过滤去除全血中的白细胞,4℃条件下,400g离心15分钟,去上清,调整红细胞压积为70-75%,血液保存冰箱4℃储存。储存时间小于2小时的作为新鲜红细胞(FRBC),储存时间为14天的作为储存红细胞(SRBC)。测定新鲜红细胞和储存红细胞的血气指标,血常规指标,红细胞携氧能力,红细胞溶血率和24小时回输存活率。结果表明,相较于新鲜红细胞,红细胞在储存的过程中,红细胞液中钠离子浓度显著降低,钾离子浓度显著升高(p(27)0.05)。相较于新鲜红细胞,红细胞在储存的过程中,溶血率显著升高(p(27)0.05),24小时回输存活率显著降低(p(27)0.05),红细胞P50值显著降低(p(27)0.05)。本实验结果提示,红细胞在储存过程中,红细胞氧分压下降,酸碱平衡受到破坏,红细胞内外钠钾离子分布异常,携氧能力降低等。本部分研究成功建立了小鼠储存红细胞体外实验平台,为丙酮酸钠在红细胞储存过程中的作用评价实验奠定基础。第二部分丙酮酸钠对红细胞储存损伤保护作用的研究本部分研究拟在第一部分构建的小鼠储存红细胞实验平台基础上,探究丙酮酸钠在红细胞储存过程中对红细胞储存损伤的保护作用。如第一部分所述方法制备去白全血,平均分2组(n=8):1)丙酮酸钠(Sodium pyruvate,SP)组,添加丙酮酸钠浓缩液使储存红细胞中丙酮酸钠的终浓度为2.5m M;2)对照(Control)组,按相同体积比加入等量的生理盐水。离心,弃上清以调整红细胞压积为70%-75%,4℃储存14天后,测定红细胞的血气指标、血常规指标、携氧能力、ATP水平、氧化应激水平、溶血率和回输24小时存活率。结果表明,与对照组比较,丙酮酸钠组总血红蛋白浓度、红细胞压积、平均红细胞体积无显著性差异;与对照组比较,丙酮酸钠组储存红细胞ATP含量显著升高(p(27)0.05),丙二醛(MDA)水平显著降低(p(27)0.05),超氧化物歧化酶(SOD)活性显著升高(p(27)0.05),P50水平显著升高(p(27)0.05)。与对照组相比较,丙酮酸钠组储存红细胞溶血率有下降趋势,回输24小时存活率有升高趋势,但两组之间都无统计学差异(p(29)0.05)。实验结果显示,在红细胞储存过程中,添加丙酮酸钠对总血红蛋白浓度、红细胞压积、平均红细胞体积无明显影响,但在红细胞储存过程中添加丙酮酸钠能够维持细胞内ATP浓度和储存红细胞携氧能力,提高储存红细胞抗氧化能力,减少红细胞氧化应激损伤。第三部分丙酮酸钠对储存红细胞回输后肝损伤的影响本部分以小鼠储存红细胞实验平台为基础,研究在红细胞储存过程中添加丙酮酸钠对储存红细胞回输造成的肝损伤的影响。如第二部分所述方法,制备添加丙酮酸钠的储存红细胞及对照组储存红细胞。通过尾静脉注射的方法,分别注射对照组和丙酮酸钠组储存红细胞,注射量为小鼠总血量的20%,回输2小时后,戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠(其注射量按75mg/kg体重计算),机械通气,心脏穿刺取血,全血以6000rpm转速离心90秒,取上层血浆并分装,-80℃保存。取肝脏组织,一部分放入液氮中保存,另一部分用4%多聚甲醛固定。测定小鼠血浆生化水平,主要有谷草转氨酶(AST)、血尿素氮(BUN)和乳酸脱氢酶(LDH),测定小鼠肝组织MDA水平,髓过氧化物酶(MPO)活性,白介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平,在此基础上,通过HE染色,观察小鼠肝组织病理变化。结果表明,相较于对照组,丙酮酸钠组小鼠血浆中AST活性显著降低(p(27)0.05);BUN水平降低(p(27)0.05);LDH活性降低(p(27)0.05)。相较于对照组,丙酮酸钠组小鼠肝组织MDA水平、MPO活性、IL-6和TNF-α水平都显著性降低(p(27)0.05);病理组织结果显示,相较于对照组,丙酮酸钠组小鼠肝组织出现较少的细胞坏死灶和中性粒细胞浸润。本实验结果显示,红细胞在储存过程中添加丙酮酸钠,可显著降低储存红细胞回输造成的机体氧化应激水平和炎症反应水平升高,改善器官损伤。综上所述,本研究基于小鼠红细胞储存模型,评价红细胞储存过程中添加丙酮酸钠对红细胞储存损伤的影响,并进一步探讨红细胞在储存过程中添加丙酮酸钠对回输后肝损伤的影响。研究结果表明,在红细胞储存过程中,添加丙酮酸钠能够改善储存红细胞能量代谢障碍、氧化应激损伤及携氧能力,并可显著改善储存红细胞回输后肝损伤。本研究为红细胞储存液的改进以及储存红细胞回输不良反应的预防提供新思路和实验依据。