论文部分内容阅读
目的探讨慢病毒介导的RNA干扰技术(RNA interference,RNAi)下调BCL-2结合抗凋亡基因(BCL-2 associated anthanogen-1,BAG-1)表达对氧糖剥夺/再复氧诱导人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)凋亡及热休克蛋白70(Heat Shock Protein 70,HSP70)表达的影响。方法构建靶向BAG-1 RNAi慢病毒载体,感染对数生长期的SH-SY5Y细胞,抑制BAG-1表达。采用荧光显微镜观察荧光,嘌呤霉素筛选细胞,保证感染效率>75%。转染成功后细胞分组如下:正常细胞组(未感染慢病毒的正常SH-SY5Y细胞);慢病毒对照组[感染含增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因的慢病毒];BAG-1 RNAi组(即BAG-1基因沉默组,感染含BAG-1基因干扰序列及EGFP的慢病毒),根据所用序列不同分为BAG-1 RNAi-α组、BAG-1 RNAi-β组。慢病毒感染后72 h采用蛋白质免疫印迹实验(Western Blot)检测BAG-1 RNAi组细胞BAG-1蛋白表达情况,确定干扰效果。4组细胞分别给予氧糖剥夺4 h,8 h,12 h,24 h并复氧24 h处理,采用细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(CCK-8)检测不同氧糖剥夺条件下各组细胞活性,确定最佳氧糖剥夺时间模拟神经细胞缺血再灌注损伤,并比较各组间细胞活性的差异。采用流式细胞仪检测氧糖剥夺8 h再复氧24 h各组细胞凋亡情况;Western Blot及实时荧光定量反转录-聚合酶链反应(RT-q PCR)检测HSP70蛋白表达及m RNA转录水平。多组样本均数间的比较采用单因素方差分析,LSD-t检验用于两两比较。结果1.慢病毒感染及BAG-1基因沉默效果:感染后72 h荧光显微镜明暗场对比显示慢病毒对照组、BAG-1 RNAi-α组、BAG-1 RNAi-β组3组细胞慢病毒感染效率均在75%以上;Western Blot结果显示,BAG-1 RNAi-β组BAG-1干扰效果优于BAG-1RNAi-α组。2.BAG-1基因沉默降低氧糖剥夺/再复氧损伤SH-SY5Y细胞活性:CCK-8结果显示,各组细胞活性随缺氧时间延长,先增强后减弱,且于8 h达峰值,因此采用氧糖剥夺8 h,再复氧24 h的SH-SY5Y细胞作为神经细胞缺血再灌注损伤细胞模型。经缺氧8 h再复氧24 h处理后,BAG-1 RNAi-β组吸光度(A值)显著低于正常细胞组、慢病毒对照组及BAG-1 RNAi-α组(A值:0.591±0.091比0.937±0.118,0.902±0.106,0.910±0.139,均P<0.01)。3.BAG-1基因沉默导致氧糖剥夺/再复氧损伤SH-SY5Y细胞凋亡增加:BAG-1RNAi-β组细胞凋亡率明显高于正常细胞组、慢病毒对照组及BAG-1 RNAi-α组[凋亡率(%):34.633±3.464比14.833±3.753,19.933±6.490,16.400±1.179,均P<0.01]。4.BAG-1基因沉默对HSP70蛋白表达及m RNA转录水平的影响:正常细胞组、慢病毒对照组、BAG-1 RNAi-α组与BAG-1 RNAi-β组细胞的HSP70蛋白表达及m RNA转录水平差异均无统计学意义(均P>0.05)。4组细胞HSP70蛋白表达(灰度值)依次为:1.440±0.105,1.325±0.169,1.355±0.232,1.430±0.117。m RNA转录水平(2-△△Ct):0.996±0.060,0.956±0.155,1.047±0.154,1.002±0.178。结论1.不同氧糖剥夺时间对细胞活性影响不同,氧糖剥夺8 h,再复氧24 h的SH-SY5Y细胞可作为神经细胞缺血再灌注损伤模型。2.BAG-1可能对氧糖剥夺/再复氧损伤SH-SY5Y细胞具有一定的保护作用。3.BAG-1基因有效沉默后,HSP70表达水平没有变化,为进一步探讨BAG-1/HSP70相互作用在缺血性脑血管疾病的研究提供一定的实验依据。