目的通过临床与实验研究总结FicatⅠ-Ⅲ期股骨头缺血性坏死(avascular necrosisof the femoral head,ANFH)综合保守治疗方法的效果,以及寻找骨坏死病灶清除术后的理想填充材料,促进骨质的修复,并初步探讨将来能够用于治疗FicatⅡ-Ⅲ期ANFH更为理想的组织工程化人工骨材料。具体内容如下:(1)分析ANFH综合非手术治疗的临床病例,评价综合保守治疗方法的疗效。(2)探讨纳米晶胶原基骨材料治疗FicatⅢ期ANFH,以及使用自体骨髓组织工程复合物治疗股骨头颈部复发性骨囊肿的临床疗效,分析病灶清除后骨缺损修复治疗时对于填充材料的选择要求。(3)自制一种磷酸钙胶原复合物,使之能够在组织工程材料中作为骨缺损的修复材料和种子细胞的载体。(4)研究碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)基因转染对于骨髓源性成骨细胞生物学特性和血管生成的影响,为组织工程化人工骨种子细胞的选择提供依据。方法(1)临床研究:回顾性分析135例确诊为ANFH患者的临床和影像学资料,患者接受的综合非手术治疗措施包括减轻负重、髋关节功能锻炼、按摩、热敷、理疗,口服活血化瘀、补髓生骨中西药物,其中80例患者行患侧股骨头供血动脉内药物灌注治疗。(2)治疗3例患者,4个FicatⅢ期坏死股骨头,在X线透视下,通过股骨大转子下方切开钻孔,行坏死区病灶清除和纳米人工骨植入。术后定期复查X线平片,2例术后CT复查,随访6-11个月。1例股骨头颈部复发性骨囊肿患者,同样方法通过股骨大转子下方钻孔进入囊肿腔内,刮除病灶后植入由自体骨髓、自体骨和甲基强的松龙混合而成的自体骨髓组织工程复合物,术后每2-3个月随访,摄X线片或CT扫描复查。(3)实验研究:将磷酸钙和磷酸氢钙与Ⅰ型胶原按35%:35%:30%的质量比例混合,采用真空冻干技术制备成海绵状复合材料,半透膜透析。体外分离培养、成骨诱导扩增兔骨髓间质干细胞(BMSCs),连续检测第1,3,5周诱导培养液上清中的碱性磷酸酶(ALP)含量、茜素红矿化染色进行成骨分化鉴定。接种具有成骨细胞表型的BMSCs在透析过的复合材料上培养,病理切片检测细胞生长状况。(4)经脂质体介导将牛pcDNA3-bFGF真核表达质粒分别转染体外培养的兔BMSCs和诱导的骨髓源性成骨细胞,G418筛选。利用RT-PCR、免疫细胞化学染色分析转染细胞的bFGF表达情况。另外,从形态、增殖特性(MTT法)和细胞周期、碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原等方面分析稳定表达bFGF的BMSCs和骨髓源性成骨细胞生物学特性。将稳定转染bFGF基因的大鼠骨髓源性成骨细胞与自制的磷酸钙胶原材料复合培养,并植于大鼠后腿肌袋内,分别于正常饲养2、4周后处死,取出植入的复合材料,制备病理切片,观察血管新生情况。结果(1)按照ANFH疗效评价标准,135例183髋,优20.8%(38/183),良48.1%(88/183),可16.9%(31/183),差14.2%(26/183),综合非手术治疗的总有效率85.8%(157/183)。(2)采用纳米人工骨植入治疗的2例3髋疗效较好,11个月后骨质修复良好,关节面塌陷无进一步加重;1例疗较效差,因患者术后过早负重,关节面塌陷较重而置换人工髋关节。使用自体骨髓组织工程复合物治疗的1例患者,5、10个月后复查,骨囊肿愈合良好,边缘硬化,无复发及并发症,按照Neer的X线骨囊肿愈合评价标准,骨囊肿Ⅳ级愈合。(3)实验研究中,BMSC体外诱导培养后,第1,3,5周分别检测培养液上清中的ALP分泌量逐渐增加(P＜0.05),茜素红矿化染色呈强阳性。病理切片示诱导后的BMSCs在磷酸钙胶原复合材料中生长良好。(4)重组牛pcDNA3-bFGF真核表达质粒成功转染目的细胞,经G418筛选稳定表达。RT-PCR结果显示稳定转染的细胞有大量目的基因mRNA转录,免疫细胞化学染色显示胞质中有目的蛋白。转染bFGF基因的BMSCs和骨髓源性成骨细胞生长均加快,细胞周期中增殖期细胞比例明显增加,细胞形态无明显变化。转染与未转染的骨髓源性成骨细胞比较,ALP的分泌量无明显变化(P＞0.05),然而,转染后BMSCs的ALP分泌量小于骨髓源性成骨细胞(P＜0.01)。RT-PCR结果显示,骨髓源性成骨细胞转染与未转染bF6F基因组均有Ⅰ型胶原mRNA表达,但是,转染和未转染的BMSCs中均无Ⅰ型胶原基因mRNA转录。转染有外源性bFGF基因的复合材料从大鼠体内取出后,病理切片观察材料部分被增生纤维结缔组织包绕,内有新生血管生成,随着时间的延长而增多。结论(1)综合非手术性治疗对于ANFH具有肯定的疗效,但是治疗时间长,患者依从性较差,预后受到一定程度的影响。(2)纳米晶胶原基复合骨可以作为骨修复材料治疗ANFH,但其缺乏生物学活性,治疗时间较长,坏死股骨头容易因过早的负重而加重塌陷。自体骨髓组织工程复合物植入治疗骨囊肿疗效确切,值得推广。(3)自制的磷酸钙胶原复合材料与诱导后的BMSCs生物相容性良好,在骨缺损修复中可以作为种子细胞的良好载体。(4)稳定表达bFGF的BMSCs和骨髓源性成骨细胞增殖较快,但作为组织工程骨的种子细胞,骨髓源性成骨细胞较BMSCs更理想。外源bFGF基因转染后稳定表达,对新生血管的形成具有促进作用,可以作为组织工程化人工骨种子细胞转染的目的基因。