慢性高原病(CMS),是一种以红细胞过度增生、血红蛋白浓度显著增加、严重的低氧血症为特征的临床综合征,主要发生于居住在海拔高于2 500m以上对低氧环境失习服的人群,由于红细胞过度增多导致全身多系统损伤,严重影响患者健康。既往对CMS的研究主要集中在红细胞分化、增殖方面,大量研究结果认为骨髓有核红细胞增殖增强在CMS患者红细胞过度增多中发挥重要作用,但其骨髓有核红细胞凋亡情况如何,在红细胞过度积累中作用如何,既往尚未进行系统研究。骨髓是成人重要的造血器官,骨髓造血细胞凋亡情况的研究对CMS发病机制及其临床干预具有重要意义。既往我们团队对CMS细胞凋亡进行了初步探讨,结果显示CMS患者骨髓单个核细胞(BMMNCs)凋亡指数下降,且与线粒体通路相关,但BMMNCs不能完全反映红系前体细胞凋亡变化的情况。基于上述初步研究结果,本论文假设CMS患者骨髓有核红细胞凋亡下调,在其红细胞积累中与红细胞增殖增强具有一定的协同作用,故本论文探讨CMS患者骨髓有核红细胞凋亡情况,以及其凋亡变化的主要信号分子通路,从细胞凋亡角度为阐明CMS发病机制积累科学依据。基于上述理由,本论文从以下两部分进行探讨:第一部分慢性高原病患者骨髓红系造血细胞凋亡变化目的:以CMS患者骨髓红系前体细胞增殖及凋亡的结果为基础,探讨红系前体细胞凋亡在CMS发生发展中的作用,深入研究红系前体细胞死亡受体途径、线粒体途径凋亡相关分子的变化。方法:以18例CMS患者为研究对象,以17例在相近海拔高度地区世居或久居的健康人或单纯陈旧性骨折患者为对照组,利用免疫磁珠分选、流式细胞术、q PCR等方法,研究CMS患者骨髓有核红细胞凋亡情况以及caspase-3、Fas、TNFR、Bcl-2家族分子、Cyt-C的变化情况。结果:1.光学显微镜下观察骨髓涂片,CMS组粒红比小于对照组(p<0.05),而中、晚幼红细胞比例明显高于对照组(p<0.001)。流式细胞术检测两组BMMNCs中CD34+细胞比例无明显变化(p>0.05),但CMS组CD71+有核红细胞比例较对照组明显升高(p<0.001),且与外周血血红蛋白水平呈正相关。2.应用流式细胞术测定CMS组骨髓CD71+有核红细胞凋亡率较对照组降低(p<0.05),线粒体膜电位高于对照组(p<0.05),提示CMS患者骨髓有核红细胞凋亡减少。应用q PCR测定两组骨髓CD71+有核红细胞凋亡相关基因,结果表明,与对照组相比,CMS组Bcl-2 m RNA表达水平增高(p<0.05),Bax m RNA表达水平降低(p<0.05),但caspase-3、Cyt-C、TNFR、Fas m RNA表达水平在两组间均未发现明显统计学差异(p>0.05)。3.流式细胞术测定两组骨髓CD71+有核红细胞凋亡相关蛋白的表达,发现CMS组caspase-3和Bax水平显著低于对照组(p<0.05),Bcl-2水平显著高于对照组(p<0.05)。而两组间TNFR、Fas和Cyt-C水平无显著差异(p>0.05),凋亡相关蛋白的表达水平与其m RNA表达水平基本一致。结论:1.CMS患者骨髓有核红细胞增殖增强,同时细胞凋亡下调,两者都与血红蛋白水平有一定的相关性,说明骨髓红系细胞增殖增强和凋亡下调是CMS患者红细胞过度积累的重要机制,两者可能发挥一定的协同作用。2.CMS患者骨髓有核红细胞中Bcl-2家族部分分子的变化,说明线粒体途径是CMS患者骨髓红系细胞凋亡下调的重要机制之一;而CMS患者骨髓有核红细胞死亡受体相关分子未发现具有统计学意义的变化。第二部分低氧暴露后大鼠骨髓有核红细胞凋亡变化研究目的:以第一部分研究结果为基础,研究大鼠在低压低氧暴露情况下骨髓有核红细胞增殖、凋亡情况,探讨凋亡通路相关的死亡受体途径、线粒体途径的相关分子变化。方法:以30只雄性SD大鼠为研究对象,随机分为3组,低氧组饲养在模拟海拔5 000m高原的低压低氧舱内,分别连续低压低氧饲养7d及28d,对照组在海拔2 260m的实验室内饲养。利用全血细胞分析、流式细胞术研究三组大鼠外周血细胞学指标、骨髓有核红细胞比例及凋亡的变化;应用光学显微镜、电镜等观察骨髓有核红细胞形态及超微结构;应用免疫磁珠分选、q PCR、WesternBlot、免疫组化等方法研究低压低氧暴露前后大鼠骨髓有核红细胞caspase-3、Fas、TNFR、Bcl-2家族分子及Cyt-C的变化情况。结果:1.光学显微镜下观察各组大鼠骨髓涂片及胸骨HE染色切片,低氧暴露后两组大鼠骨髓粒红比明显小于对照组(p<0.001),中、晚幼红细胞比例及幼红细胞岛数量明显高于对照组(p<0.001),电镜下观察发现低氧暴露后骨髓有核红细胞数量增多,线粒体数量增多伴肿胀。流式细胞术检测了BMMNCs中CD71+有核红细胞的百分比,结果显示随着低氧暴露时间延长,CD71+有核红细胞比例明显升高(p<0.001)。2.应用流式细胞术测定大鼠骨髓CD71+有核红细胞凋亡情况,结果发现,与对照组相比,低氧暴露28d后CD71+有核红细胞凋亡率显著增高(p<0.05)。应用q PCR测定大鼠骨髓CD71+有核红细胞凋亡相关基因的变化,结果显示低氧暴露后两组大鼠CD71+有核红细胞caspase-3、Bax、Cyt-C表达水平均较对照组增高(p<0.05),TNFR、Fas、Bcl-2表达水平在低氧暴露组和对照组间均未发现明显统计学差异(p>0.05)。3.应用Western Blot测定大鼠骨髓CD71+有核红细胞凋亡相关蛋白的表达,结果发现,与对照组相比,低氧暴露后两组CD71+有核红细胞caspase-3、Bax、Bcl-2、Cyt-C表达水平均明显增高(p<0.01),TNFR、Fas表达水平在低氧暴露组和对照组间均未发现明显统计学差异(p>0.05);应用免疫组化测定胸骨骨髓腔内细胞caspase-3表达,结果显示随着低氧暴露时间的延长,caspase-3表达逐渐增高。结论:1.低氧暴露后大鼠外周血、骨髓红系细胞增殖增强,同时细胞凋亡也增加,说明大鼠骨髓红系造血受到增殖和凋亡的双向调控。2.低氧暴露前后大鼠骨髓有核红细胞中caspase-3及线粒体途径相关因子的变化,说明线粒体途径是大鼠骨髓红系前体细胞凋亡变化的重要途径之一,而死亡受体相关分子未发现具有统计学意义的变化。综上所述,长期居住在高原地区的CMS患者和短期饲养在低压低氧舱的模型动物,都会出现外周血红细胞数量增多、血红蛋白浓度升高等血液学特点,骨髓作为重要的造血器官在低氧条件下都表现为有核红细胞增殖增强。CMS患者骨髓有核红细胞凋亡较同海拔健康人下降,其主要机制与线粒体信号途径有密切关系,骨髓有核红细胞凋亡下调可能对CMS患者外周血红细胞过度积累有促进或加重作用,研究为进一步阐明CMS患者红细胞过度增加机制积累了新的科学依据。低氧暴露的模型动物其凋亡则较对照组明显升高,可能与低氧暴露时间、条件及实验物种的不同有关。