【摘 要】
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转录因子（Transcriptionfactor）是一类DNA结合蛋白,通过与特定位点结合,在信号传导中起重要作用。Atf1是ATF/CREB类碱性亮氨酸拉链转录因子家族成员,是HOG MAPK信号途径下游靶标。目前,在许多植物病原真菌中,HOG MAPK信号途径及转录因子Atf1能够在生长发育、胁迫响应或病原菌的致病能力等方面发挥作用,但机理仍不明确。暹罗炭疽菌（Colletotrichum s
【基金项目】
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海南省基础与应用基础研究计划高层次人才项目（320RC477,2019RCO35）； 国家自然科学基金（No.32160613,No.31760499）； 现代农业产业技术体系建设专项资金项目（No.CARS-33-BC1）；
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转录因子（Transcriptionfactor）是一类DNA结合蛋白,通过与特定位点结合,在信号传导中起重要作用。Atf1是ATF/CREB类碱性亮氨酸拉链转录因子家族成员,是HOG MAPK信号途径下游靶标。目前,在许多植物病原真菌中,HOG MAPK信号途径及转录因子Atf1能够在生长发育、胁迫响应或病原菌的致病能力等方面发挥作用,但机理仍不明确。暹罗炭疽菌（Colletotrichum siamense）是橡胶树炭疽病的主要病原,前期实验初步表明转录因子CsAtf1同上游HOG MAPK信号途径CsPbs2类似,都参与暹罗炭疽菌对咯菌腈敏感性的调控。基于前期基础,本研究进一步研究和解析转录因子CsAtf1功能,利用ChIP-Seq和RNA-Seq技术分析CsAtf1调控靶基因,利用凝胶阻滞实验验证CsAtf1和靶基因的结合,qRT-PCR技术分析CsAtf1对靶基因表达的影响。研究结果可为深入了解转录因子CsAtf1下游调控药剂敏感性和影响致病性的靶基因奠定基础。主要研究结果如下:1、转录因子CsAtf1和上游HOG MAPK途径成员编码基因表达关系分析:本研究采用荧光定量PCR法,分别测定了在HOGMAPK途径激活剂茴香霉素、抑制剂SB203580以及咯菌腈药剂处理和不处理野生型HN08菌株时,CsAtf1和HOG MAPK途径成员基因CsPbs2、CsHog1的表达变化情况。结果显示,与对照组相比,茴香霉素处理后,CsPbs2、CsHog1和CsAtf1基因的表达量分别显著上调;SB203580处理后,三基因表达量分别显著下调;咯菌腈处理后,三基因表达量分别显著上调。该结果说明CsAtf1基因与上游HOG MAPK途径成员基因存在协同表达关系,能够应答咯菌腈上调表达。2、转录因子CsAtf1功能验证:构建回补突变体ΔCsAtf1/CsAtf1,观察比较野生型、缺失突变体ΔCsAtf1和回补菌株ΔCsAtf1/CsAtf1的表型。与野生型相比,ΔCsAtf1菌落生长速率降低,分生孢子变得细小、萌发率降低,附着胞形成率降低,且大量附着胞不能正常黑化,致病能力降低,突变体在含刚果红和NaC1的CM培养基中生长速率降低。结果证实了 CsAtf1影响炭疽菌形态建成和致病性,影响细胞壁完整性和对NaCl胁迫的反应,但不影响对糖胁迫及氧化胁迫的应答。在药剂敏感性方面,本研究细致观察了ΔCsAtf1菌丝和分生孢子对咯菌腈敏感性调控的表型。研究显示,在含药平板上,无论接种体是分生孢子还是菌丝体,上游ΔCsPbs2突变体均比野生型HN08抗咯菌腈,但突变体ΔCsAtf1仅在接种分生孢子时表现抗咯菌腈胁迫;进一步显微镜观察显示,咯菌腈能抑制野生型分生孢子的萌发,但缺失CsAtf1基因时,咯菌腈反而可以促进突变体分生孢子的萌发而表现对咯菌腈的抗性。3、转录因子CsAtf1靶基因分析:为进一步解析转录因子CsAtf1参与相关功能调控的分子机制,综合ChIP-Seq和RNA-Seq分析,在全基因组范围内筛选与CsAtf1互作且表达发生显著差异的基因,获得CsAtf1调控的潜在靶标基因3809个。鉴于CsAtf1主要影响分生孢子萌发、附着胞形成及药剂敏感性,本研究在CsAtf1直接调控的基因库中,筛选到24个细胞色素氧化酶家族基因（含CsCYP51基因和影响菌丝生长的CsSCS7基因）,以及7个影响分生孢子和附着胞形态建成的相关基因,推测转录因子CsAtf1可能通过影响这些基因的表达来影响炭疽菌形态建成和对药剂的敏感性。4、转录因子CsAtf1调控靶基因CsCYP51和CsSCS7表达的验证:利用凝胶阻滞实验,验证了 CsAtf1蛋白可与CsCYP51基因启动子区和CsSCS7编码区结合;qRT-PCR分析证实了缺失CsAtf1基因可促进靶基因CsCYP51基因和CsSCS7基因上调表达。说明在野生型中,CsAtf1起着阻滞靶基因CsCYP51和CsSCS7表达的功能。
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