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细胞色素P450酶(cytochrome P450,CYP)又称混合功能氧化酶和单加氧酶,是一类以血红素为辅基的b族细胞色素的超家族蛋白酶,其中CYP2A6和CYP2C9不仅分别参与临床约3%和15%药物的代谢,还能代谢和/或活化多种前致癌物、前毒物及致突变剂。目前发现多种药物代谢酶含量和活性在个体间和种族间都呈现出显著的差异性,从而在对临床用药、环境化合物和前致癌物的毒性作用的敏感性上表现出个体差异。通常CYP酶的基因多态性可能是引起个体差异的主要原因之一。CYP2A6和CYP2C9基因具有高度的遗传多态性,以往的相关研究多在重组酶体系和人体体内展开,前者虽能较好的反映单一酶活性,但与人体内环境相差较远,后者虽接近人体内环境,但涉及药物体内处置的多个环节,不能单一反映代谢过程。综合来说,人肝是人体最为接近的体外代谢平台。本研究拟以肝功能正常的人肝标本为研究对象,考察基因多态性对CYP2A6和CYP2C9代谢探针药物香豆素(coumarin, COH)和甲苯磺丁脲(tolbutamide,TOB)的影响,以期为临床合理应用经CYP2A6和CYP2C9代谢的药物提供理论依据。方法1人肝标本收集正常人肝标本108例,年龄20-75岁(中位数为47岁)。男性和女性分别为36例和72例,有吸烟史和饮酒史的分别为12例和96例,用药史显示近期均未用明显影响CYP酶活性的药物。本试验方案经郑州大学医学伦理委员会批准,受试者签署知情同意书。2CYP2A6和CYP2C9的基因分型采用DNA提取试剂盒从肝组织中提取基因组DNA。用CYP2A6、CYP2C9引物扩增含突变位点的基因片段,通过测序确定受试者的基因型。3人肝微粒体的制备采用差速离心法制备人肝微粒体,Bradford法测定肝微粒体蛋白含量。CYP2A6和CYP2C9的体外探针分别选择香豆素和甲苯磺丁脲,并以探针药物的生物转化程度(TR)作为反应速度。4探针药物及代谢物浓度的测定人肝微粒体孵育体系中加入探针药物、磷酸盐缓冲液等,预孵育后加入NADPH启动反应,孵育后加入高氯酸终止反应,涡旋、离心,取上清进行分析测定。并进行孵育条件的优化,选择最合适的孵育时间和微粒体蛋白浓度。实验所用探针药物及其孵育体系中代谢物的浓度测定均选用HPLC法。结果表明,所建立的药物测定方法专属性高,精密度、回收率良好,RSD<15%,均符合生物样本的测定要求。5人肝酶动力学参数的测定CYP2A6底物香豆素的浓度范围为0.15625～20μM,CYP2C9底物甲苯磺丁脲的浓度范围为31.25～2000μM。CYP2A6和CYP2C9孵育体系中蛋白浓度分别为0.3mg·ml-1和0.5mg·ml-1孵育时间分别为30min和60min,分别测定105例人肝CYP2A6和108例人肝CYP2C9的酶动力学参数Km、Vmax和CLint。6统计方法采用GraphPad Prism5.0软件计算酶动力学参数,SPSS17.0统计软件对各项数据资料进行统计学分析。酶动力学参数进行正态性检验,对于非正态分布的,采取非参数检验进行相关分析。检验水准α为0.05,P<0.05认为有统计学意义。结果1CYP2A6基因型对人肝微粒体代谢香豆素的影响1.1人肝微粒体代谢香豆素的酶动力学正态性检验结果表明,人肝微粒体CYP2A6代谢香豆素的酶动力参数呈非正态分布,因此本实验采用非参数检验进行统计分析。105例人肝微粒体代谢香豆素的酶动力学参数K-m、Vmax和CLint分别2.33(0.78～10.09)μM、354.4(3.7～1430.0) pmol·min-1·mg-1protein、144.5(1.2～544.7)μl·min-1·mg-1protein。 Km、Vmax和CLint差异倍数分别为12.9、386.5和453.9倍。结果显示,CYP2A6代谢香豆素的酶动力学参数Km、Vmax和CLint呈现出较大的个体差异性。1.2CYP2A6*1B基因型与香豆素代谢CYP2A6*1B的突变频率为53.3%。CYP2A6代谢香豆素的酶动力学参数Km、Vmax和CLint在CYP2A6*1A/*1A,*1A/*1B和*1B/*1B三组中都无显著的差异性。结果显示,CYP2A6*1B突变对人肝CYP2A6的代谢活性无明显影响。1.3CYP2A6*4基因型与香豆素代谢105例样本中基因型为CYP2A6*1/*和*1/*4的样本分别有90和15例。CYP2A6*4的突变频率为7.1%CYP2A6*1/*1和*1/*4基因型人肝微粒体Km、*max和CLint分别为2.44(0.87～10.09)和1.18(0.78～7.88)μM,374.5(49.7～1430.0)和42.5(3.7～495.1)pmol·min-1mg-1protein,147.4(27.4～544.7)和43.2(1.2～209.7)μl·min-1·mg-1protein,前者Km、Vmax和CLint均显著高于后者(P<0.05)。结果显示,CYP2A6*4突变明显降低人肝CYP2A6对香豆素的代谢活性。1.4CYP2A6*9基因型与香豆素代谢CYP2A6*9的突变频率为23.3%。CYP2A6*1/*1、*1/*9和*9/*9基因型人肝微粒体的Km分别为2.72(0.98～10.09)、2.09(0.87～6.18)和1.27(0.89～1.96)μM,前者显著高于后两者(P<0.05)。CYP2A6*9/*基因型的Vmax为179.2(117.4～248.9)pmol-min-1·mg-1protein显著低于*1/*1基因型417.2(49.7～1430.0)pmol-min-1·mg-1protein。结果显示,CYP2A6*9突变明显降低CYP2A6对香豆素的代谢活性。2CYP2C9基因型对人肝微粒体代谢甲苯磺丁脲的影响2.1人肝微粒体代谢甲苯磺丁脲的酶动力学正态性检验结果表明,人肝微粒体CYP2C9代谢甲苯磺丁脲的酶动力参数呈非正态分布,因此本实验采用非参数检验进行统计分析。108例人肝微粒体代谢甲苯磺丁脲的酶动力学参数Km、Vmax和CLint分别230.4(101.2～555.3)μM、254.1(82.4～454.8) pmol·min-1·mg-1protein、1.11(0.17～4.18)μl·min-1·mg-1protein。 Km、Vmax和CLint差异倍数分别为5.5、5.5和24.6倍。结果显示,CYP2C9代谢甲苯磺丁脲的酶动力学参数Km、Vmax和CLint呈现出较大的个体差异性。2.2CYP2C9*3基因型与甲苯磺丁脲代谢108例样本中基因型为CYP2C9*1/*1、*1/*3的样本分别有102和8例。CYP2C9*3的突变频率为2.78%。CYP2C9*1/*1、*1/*3基因型人肝微粒体的Km、Vmax和CLint分别为217.9(101.2～555.3)和324.7(266.3～510.9)μM,257.1(83.8-454.8)和172.6(82.4～207.0)pmol·min-1·mg-1protein,1.18(0.17～4.18)和0.47(0.30～0.78)μl·min-1·mg-1protein,前者Km显著低于后者,Vmax和CLint均显著高于后者(P<0.05)。结果显示,CYP2C9*3突变明显降低人肝CYP2C9对甲苯磺丁脲的代谢活性。结论1.人肝CYP2A6和CYP2C9对其药物代谢呈现出了较大的个体差异性。2. CYP2A6*4、CYP2A6*9突变明显降低人肝微粒体CYP2A6的代谢活性；而CYP2A6突变对其代谢活性则无明显影响。3. CYP2C9*3突变明显降低人肝微粒体CYP2C9的代谢活性。4.人肝CYP2A6和CYP2CP相同基因型内部代谢活性仍有较大差异。