宫颈癌是女性生殖道最常见的妇科恶性肿瘤之一,在世界范围每年新增病例是50万。晚期宫颈癌和治疗后复发患者免疫功能的抑制,使得预后难以改善;虽然部分早期患者通过手术切除,能够治愈,手术造成生活质量的下降、生育功能的丧失或流产、早产的增加等,因此探索新的治疗策略势在必行。作为恶性肿瘤第四种治疗模式的生物治疗研究蓬勃发展,如何改善宫颈癌治疗现状,在有效治疗的同时提高患者的生存质量甚至保留年轻患者的生育功能,免疫治疗是较为活跃的领域。细胞因子治疗是肿瘤免疫治疗的重要组成部分,它是基于对免疫反应具有调控作用,可以提高抗原呈递作用,并能加强细胞毒性抗肿瘤反应,目前临床上已应用IL-2、CSF、IFN、TNF-α等治疗肿瘤。IL-21是新近发现的细胞因子,属IL-2家族成员之一,主要是由CD4+T细胞分泌的,为Th1细胞因子,可以诱导被激活的T和NK细胞的增值,并提高了细胞毒性T细胞和NK细胞的溶解的功能,因此具有明显的抗肿瘤作用。基因转染的载体多种多样,包括以腺病毒、脂质体、细胞电穿孔等。但是前两者具有生物不安全、免疫源性高,不稳定等因素,而脉冲电场作为载体能克服上面这些问题。脉冲电场能使细胞膜的通透性增加,脂质双膜结构发生改变,形成纳米级的亲水孔。一定场强范围内能产生可逆(reversible electroporation RE)和不可逆电穿孔(irreversible electroporation IRE)。IRE是一种新型的微创组织消融技术,不同于其它热消融技术,具有很多优势如:能量可控、能够监测、不受血流的影响,尤其是肿瘤组织的消融具有独特的治疗效果,利用正常组织和肿瘤组织的介电常数的不同,可以达到肿瘤细胞的消融。肿瘤细胞膜的持续穿孔及渗透作用,导致肿瘤细胞凋亡或死亡,而不影响间质细胞和大血管;局部创面很快愈合,对周围正常组织不造成损伤,死亡的细胞引流至淋巴结,在局部形成炎性细胞的浸润,不利于肿瘤细胞通过淋巴通道转移。由于宫颈的解剖位置利于电极的放置,宫颈癌是IRE治疗肿瘤的最佳器官之一。但是随着电场的衰减,在周围可能残存有肿瘤细胞的区域形成不可逆穿孔,这些被可逆穿孔的肿瘤细胞势必再次增殖而复发,因此我们将IL-21基因配伍在IRE周围,在消融一定量的肿瘤实质的同时,使残存的肿瘤细胞能转染IL-21基因,在改变肿瘤的抗原的同时增强机体的抗肿瘤作用。为一种新型的肿瘤综合治疗方法提供理论和实验依据。第一章IRE对宫颈癌细胞消融的电参数的筛选目的:通过在活体外实验,筛查出IRE诱导宫颈癌细胞株完全消融电参数组合,同时找出不能完全消融脉冲参数对肿瘤细胞生物特性的影响。同时优化基因转染的电参数组合方法:(1)将HeLa细胞悬液按场强从0.5kV/cm,梯度增加0.25kV/cm到2.5kV/cm,共9组,并设置对照组,固定脉宽100μs和频率1Hz,8个脉冲为一套。(2)作用后的细胞在0h、6h和24h用苔盼蓝计数细胞的死亡率;细胞爬片6小时Giemsa染色证实电场作用于细胞的量效关系,以及免疫组化S-P法检测凋亡蛋白Caspase-3的表达;(3)作用后的细胞24小时MTT检测细胞活力;流式细胞术检测细胞的周期改变和凋亡;(4)用接近和达到半致死的场强间隙作用2-3次以找寻完全的宫颈癌细胞消融参数(5)在半致死场强以下的电参数转染GFP质粒优化转染基因的电参数。结果:0h苔盼蓝细胞计数0-1.5kV/cm之间没有差异,对照组与1.75-2.5kV/cm之间有明显的差异;6h、24h计数,对照组与1-2.5kV/cm之间出现了差异,Giemsa染色直观的显示了这个结果;6h细胞爬片免疫组化检测Caspase-3的表达,在1.5-2.5kV/cm的阳性信号明显的高于对照组,通过流式细胞术检测细胞凋亡,对照组与2-2.25kV/cm之间有明显的差异;0.5-1.75kV/cm组较对照组有增高的趋势;流式细胞术检测2-2.5kV/cm作用下细胞G2期的细胞数明显增高;24小时MTT结果0.5-1.75kV/cm之间增殖没有差异性,2-2.5kV/cm作用下细胞增殖受到明显的抑制。1.75-2.5kV/cm在电场间隙性作用3套时细胞能够完全消融,而没有热量的叠加。适时温度的检测,室温对流的情况下,各脉冲电场的温升,最高仅为4.9±1.17。结论:随着电场的增加,细胞从RE到IRE,此过程中场强和脉冲个数同等重要,单独使用IRE是可以用于癌肿的治疗产生的热效应可以忽略,细胞死亡除了不可逆电穿孔机制外,可能还涉及了细胞凋亡途径。值得注意的是,用脉冲电场消融肿瘤时,务必要对肿瘤细胞实现完全杀伤,否则,细胞周期的改变可能会导致肿瘤的复发和加速生长。第二章IL-21基因对HeLa细胞转染后的生物学影响第一节人源性IL-21基因的构建和鉴定目的:新近发现的Th1细胞因子IL-21具有广泛的免疫调节功能和抗肿瘤作用,是由被激活的CD4+ T细胞分泌,为了获得IL-21mRNA我们通过CD3和CD28抗体与外周血淋巴细胞共刺激,提取mRNA。方法:1)分离人外周血淋巴细胞,在体外与CD3/CD28抗体共培养,提取总的mRNA,设计引物, RT-PCR法扩增片段,割胶纯化载体pcDNA4/HisMax-IL-21的连接反应2)CaCl2法制备感受态菌,并将pcDNA4/HisMax-IL-21转化至感受态TOP10,蓝白筛选后震荡培养3)用Qiagen-tipl00抽提试剂盒进行pcDNA4/HisMax-IL-21质粒的大量扩增4)用XhoI/HindlII双酶切1%的琼脂糖凝胶电泳及送invitrogen公司测序鉴定结果:从人外周血淋巴细胞中提取的总RNA,用紫外分光光度仪测定OD260/OD280=0.359/0.182=1.97表明RNA的质量完整。RT-PCR法扩增出一条带,与分子量Manker比较,约为489bp大小的特异性条带,与预期设计的全长IL-21cDNA的大小相符合。被酶切的质粒出现两条带,约5.3kb、489bp,分别与pcDNA4/HisMaxA和IL-21基因的片段大小一致。测序结果经NCBI提供的BLAST程序分析对比,显示本实验获得的IL-21序列与genebank公布的IL-21基因序列一致结论:通过在外周血淋巴细胞内加入CD3/CD28抗体,进行共刺激后,提取的mRNA在引物的作用下,成功的扩增了IL-21cDNA ;并与质粒载体连接;产物经过双酶切和测序,与genebank公布的IL-21基因序列一致第二节IL-21基因转导人宫颈癌HeLa细胞产生的生物学影响目的:为了探索人源性IL-21转导至HeLa细胞对其有无生物学影响方法:我们将成功构建并鉴定的的人源性IL-21质粒及质粒载体,用已经优化的电参数组合电转染至人宫颈癌HeLa细胞内;通过质粒Zeocin抗性筛选出具有IL-21和载体的HeLa细胞(HeLa-IL-21和HeLa-vector);细胞生长曲线的绘制,MTT检测比较HeLa、HeLa-vector和HeLa-IL-21生长活力,流式细胞术检测三者的周期和凋亡。结果:HeLa、HeLa-vector和HeLa-IL-21生长活力没有明显的不同,流式细胞术检测的各细胞凋亡及周期也没有明显的不同结论:转导人源性IL-21基因至HeLa细胞内,没有对HeLa细胞造成生物学的影响。第三章IL-21基因转导人类宫颈癌细胞产生T和NK细胞依赖的抗肿瘤作用目的:检测肿瘤细胞内表达白介素-21(IL-21)移植到小鼠体内能否产生抗肿瘤作用。方法:用包含有人IL-21的质粒电转染至宫颈癌HeLa细胞,移植到用人外周淋巴细胞免疫重建和非免疫重建的SCID(severe combined immunodeficiency)小鼠体内,并用抗唾液酸神经节苷酯(anti-asialo GM1)删除小鼠的NK细胞,以及LDH法检测荷瘤鼠的脾细胞毒性和ELSAL双夹心法检测对靶细胞产生的IFN-γ。结果: HeLa-IL-21细胞在免疫重建和非免疫重建小鼠中的生长完全被抑制,HeLa细胞在免疫重建鼠中的生长较非免疫重建小鼠滞后,肿瘤体积也明显小。删除NK细胞后暂时消除了HeLa-IL-21对肿瘤的生长抑制,同时非免疫重建组消除肿瘤生长抑制较免疫重建组明显;荷HeLa-IL-21细胞小鼠脾细胞毒性在免疫重建组高于非免疫重建组和荷HeLa细胞组,对靶细胞产生IFN-γ的量也大于非免疫重建和荷HeLa细胞组。结论表达IL-21的HeLa细胞能产生依赖NK细胞和T淋巴细胞介导的抗肿瘤作用。脉冲电场;IRE;RE;IL-21;宫颈癌