研究背景和研究目的基因组序列分析的结果表明在人类基因组中只有不到2%的基因能翻译成蛋白质,而其余98%左右的基因都是转录成非编码RNA。其中,长非编码RNA (long noncoding RNA, lncRNA)的功能和作用机制倍受关注。LncRNA是长度上大于200个碱基的非编码RNA,在哺乳动物中占转录本的4%—9%。目前的研究发现lncRNA在基因表达调控,表观遗传学调节,干细胞分化等多种生物学过程中都发挥着重要作用。在之前的研究中,我们利用新型丁内酯衍生物3-苄基-5-(2-硝基苯氧甲基)-γ-丁内酯(3BDO)发现了一个来源于转化生长因子β2 (TGFB2) 3’UTR的lncRNA, TGFB2-OT1。由于TGFB2-OT1位置的特殊性,利用传统遗传学方法无法特异性地阻断其表达。我们先前的研究结果表明,3BDO可以通过促进T细胞限制性胞内抗原-1(TIA1)的磷酸化抑制TGF2-OT1的产生,表明TIA1是参与调控TGFB2-OT1表达的重要因子,而3BDO是研究TGFB2-OT1功能的有力工具。另外,3BDO能够抑制脂多糖(LPS)诱导的核转录因子1(NUPR1)的上调及其对内皮细胞的损伤。NUPR1是重要的转录因子,因此,我们推断NUPR1可能参与TIA1的表达调控,进一步影响TGFB2-OT1的产生。在本论文中,我们拟证明该推断。鉴于TIA1的磷酸化程度是控制TGF2-OT1产生的关键,因此,寻找能够直接影响TIA1磷酸化的因子是调控TGF2-OT1表达的另一思路,目前尚未发现能够抑制TIA1磷酸化的因子。在本论文中,我们拟解决这一重要问题。先前,利用酵母双杂交和免疫共沉淀的方法,我们发现膜联蛋白A7(ANXA7)能与TIA1相互作用。同时,进一步鉴定发现在血管内皮细胞中苯并嗯嗪衍生物2,3-二氢-3-羟甲基-6-氨基-1,4-苯并噁嗪(ABO)能够靶向ANXA7,抑制ANXA7的GTPase活性,以及其相互作用蛋白的磷酸化,因此,我们推断ANXA7可能是影响TIA1磷酸化的重要因子。在本研究中,我们拟以化学小分子3BDO和ABO为工具,证明我们的推断。血管内皮细胞(Vascular endothelial cells, VECs)在机体内可直接与血液接触,是心血管封闭系统的形态基础。内皮细胞功能的异常与多种心血管疾病的发生发展相关,而炎性因子的刺激往往会引起内皮的功能紊乱。例如,在炎性因子的刺激下,内皮会发生活化,引起炎性细胞水平增加,并促进动脉粥样硬化斑块的发生和发展。因此,发现介导内皮细胞炎症反应的新因子对于心血管疾病的治疗具有重要的意义。在血管内皮生物学中,对于lncRNA的研究才刚刚开始,并且目前关于lncRNA在炎症中的研究主要集中在其它的细胞类型中,例如巨噬细胞。因此,对于lncRNA在介导内皮细胞炎症反应中的作用还未搞清。我们之前的研究结果表明,TGFB2-OT1能够作为竞争性内源RNA (Competing endogenous RNA, ceRNA),结合MIR4459,通过上调ATG13的表达来促进自噬。而在体内外3BDO的处理均能够抑制炎性诱导因子氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)引起的炎性因子的产生。自噬和炎症是两个关系十分密切的生物学过程。自噬会调节炎症反应,而炎症相关因子会影响自噬。因此,我们推测TGFB2-OT1可能参与炎症反应。在本论文中,为了证明该推断,我们深入研究了TGFB2-OT1在内皮细胞自噬和炎症反应中的作用及其分子机制。综上所述,本论文旨在研究lncRNA TGFB2-OT1的表达调控及其生物学功能,以生物活性的化学小分子为工具,研究TGFB2-OT1在内皮细胞自噬和炎症中的表达调控及其作用机制,鉴定出参与此过程的新的关键因子和信号通路,为治疗心血管疾病提供新的靶点和有效工具。研究内容1.研究NUPR1和TIA1对TGFB2-OT1的表达调控及其机制。2.研究TIA1与ANXA7的相互作用及其调控TGFB2-OT1表达的机制。3.研究TGFB2-OT1在血管内皮细胞的炎症反应中的作用。4.研究TGFB2-OT1调控血管内皮细胞自噬和炎症反应的分子机制。研究方法1.本论文是以人脐静脉内皮细胞(HUVEC)和人胚肾细胞(HEK293细胞)为细胞模型,以apoE-/-小鼠为动物模型,以化学小分子ABO和3BDO为工具,进行相关研究。2.检测NUPR1和TIA1对TGFB2-OT1的表达调控：2.1利用原位杂交和荧光定量PCR技术检测在血管内皮细胞中,有无3BDO存在时,LPS对TGFB2-OT1表达水平的影响。2.2利用Western blot检测LPS对TIA1蛋白水平的影响,以及oxLDL对NUPR1和TIA1蛋白水平的影响。2.3利用RNA干扰技术,Western blot以及荧光定量PCR方法检测NUPR1和TIA1在调控TGFB2-OT1表达中的上下游关系。3.检测ANXA7和TIA1的相互作用及其调控方式：3.1 以时间依赖的方式用ABO处理血管内皮细胞,提取蛋白,利用免疫共沉淀技术检测ABO对TIA1和ANXA7相互作用的影响。3.2以时间依赖的方式用ABO处理血管内皮细胞,以TIA1 siRNA处理组来确定磷酸化条带的特异性,免疫沉淀检测ABO对TIA1磷酸化水平的影响。3.3用ANXA7 siRNA下调ANXA7的表达后,再用ABO处理,免疫沉淀检测ANXA7对TIA1磷酸化水平的影响。4.检测ANXA7和TIA1对TGFB2-OT1的表达调控：4.1利用半定量PCR技术检测血管内皮细胞中ABO处理对TGFB2-OT1水平的影响。4.2利用Western blot检测血管内皮细胞中ABO处理对ATG13蛋白水平的影响。4.3利用RNA干扰技术,Western blot以及免疫荧光检测下调TIA1的表达后,ABO诱导的自噬水平变化。4.4在血管内皮细胞中,用3BDO和ABO共同处理,利用Western blot免疫荧光检测LC3-Ⅱ的蛋白水平和在细胞中的分布,以明确自噬水平的变化。5. ANXA7和TIA1作用机制的体内验证：5.1用高脂饲料喂养apoE-/-小鼠,建立动脉粥样硬化斑块模型,腹腔注射ABO(50 mg/kg/day)和等剂量的DMSO。5.2取胸主动脉,进行冰冻组织切片,以CD31作为内皮层的标记,利用免疫荧光双染色的方法检测内皮层上ANXA7和TIA1相互作用的变化。5.3在冰冻组织切片上,以CD31作为内皮层的标记,利用免疫荧光染色的方法检测内皮层上ATG13的水平变化。6.能够与TGFB2-OT1结合的新的microRNA的鉴定：6.1利用microRNA芯片寻找受到TGFB2-OT1调控的microRNA。6.2生物信息学预测能够与TGFB2-OT1结合的microRNA。6.3结合microRNA芯片和生物信息学预测的结果,选择合适的microRNA,利用荧光定量PCR方法进行验证。6.4构建荧光素酶报告基因载体,将TGFB2-OT1野生型cDNA以及分别突变与MIR3960和MIR4488结合位点的TGFB2-OT1突变型cDNA克隆到荧光素酶报告基因下。将野生型以及突变型荧光素酶报告基因载体分别与MIR3960和MIR4488 mimics共同转染HEK293细胞。利用双荧光素酶活性检测试剂盒检测荧光素酶的活性,证明MIR3960和MIR4488能够与TGFB2-OT1直接结合。7.MIR3960和MIR4488靶点的验证：7.1生物信息学预测MIR3960和MIR4488的靶基因。7.2利用MIR3960和MIR4488的mimics和inhibitor,研究其对靶基因mRNA和蛋白水平的影响。7.3将CERS1和NAT8L的3’UTR分别克隆到荧光素酶报告基因下,与MIR3960和MIR4488 mimics分别转染HEK293细胞。利用双荧光素酶活性检测试剂盒检测荧光素酶的活性,验证MIR3960和MIR4488与靶基因CERS1和NAT8L的直接结合。7.4利用Western blot和过表达技术,检测TGFB2-OT1对靶基因CERS1和NAT8L的影响。8.MIR4459的靶基因LARP1在内皮细胞炎症中的作用检测：8.1在血管内皮细胞中,利用MIR4459 mimics转染检测LAPR1水平的变化。8.2利用Western blot和过表达技术,检测TGFB2-OT1对LAPR1水平的影响。8.3检测MIR4459 mimics转染对SQSTM1水平的影响。8.4利用过表达技术,Western blot以及荧光定量PCR技术检测TGFB2-OT1对SQSTM1下游因子半胱氨酸蛋白酶1(Caspase 1)切割及白介素1β(IL1B)水平的影响。9.阴性对照载体lncRNA AF007131在炎症反应中作用的检测：9.1在血管内皮细胞中,利用过表达技术,Western blot以及免疫荧光方法检测AF007131对SQSTM1水平和分布的影响。9.2利用过表达技术和免疫荧光方法检测AF007131对NFKB RELA亚基在血管内皮细胞中分布情况的影响。研究结果1. NUPR1通过促进TIA1的蛋白水平上调TGFB2-OT1的表达。1.1在血管内皮细胞中,原位杂交以及荧光定量PCR结果显示,LPS处理以时间和剂量依赖的方式上调TGFB2-OT1的水平,而用3BDO同时处理时,会抑制TGFB2-OT1水平的上调。1.2在血管内皮细胞中,LPS和oxLDL的处理均会上调NUPR1和TIA1的蛋白水平,而3BDO会抑制NUPR1和TIA1蛋白水平的上调。1.3在血管内皮细胞中,干扰掉NUPR1或TIAl的表达后,LPS就不能诱导TGFB2-OT1水平的上调。1.4在血管内皮细胞中,干扰掉NUPR1的表达后,LPS就不能引起TIA1蛋白水平的上调。2.ABO促进TIA1和ANXA7的相互作用,抑制TIA1的磷酸化。2.1在血管内皮细胞中,用ABO处理2h和3h会明显促进ANXA7和TIA1的相互作用。2.2 ABO处理血管内皮细胞3 h,会明显抑制TIA1丝氨酸位点的磷酸化水平,干扰掉ANXA7的表达后,ABO对TIA1磷酸化水平的影响被抑制。2.3在干扰掉TIA1的表达后,ABO就不能上调LC3-II的蛋白水平及其在血管内皮细胞中的点状聚集,也不能下调SQSTM1的水平,表明TIA1通过与ANXA7相互作用参与到ABO诱导的自噬过程中。3. ANXA7和TIA1的相互作用促进TGFB2-OT1的产生。3.1在血管内皮细胞中,ABO处理12 h和24 h会上调TGFB2-OT1和ATG13的水平。3.2用3BDO和ABO共同处理血管内皮细胞,会明显抑制ABO诱导的LC3-Ⅱ蛋白水平的上调以及在细胞中的点状聚集。4.在apoE-/-小鼠主动脉内皮层上,ABO能够上调ANXA7和TIA1的相互作用,促进ATG13的表达。4.1利用免疫荧光双染方法,发现ABO处理明显上调ANXA7和TIA1在主动脉内皮层上的共定位。4.2 ABO处理组,小鼠主动脉内皮层上ATG13的蛋白水平也有明显提高。5. TGBFB2-OT1能够直接结合MIR3960和MIR4488。5.1在血管内皮细胞中,用3BDO处理下调TGFB2-OT1的表达,或者是用pCMV6-TGFB2-OT1载体转染上调TGFB2-OT1的表达后,分别进行microRNA芯片检测。同时用生物信息学预测能够与TGFB2-OT1结合的microRNA。综合二者结果进行分析,找到五个潜在microRNA。通过表达丰度以及靶基因情况的筛选,确定进一步研究对象为MIR3960和MIR4488。5.2对芯片结果进行验证。血管内皮细胞中3BDO处理会明显上调MIR3960和MIR4488的水平,而TGFB2-OT1的过表达会抑制MIR3960和MIR4488的水平。5.3荧光素酶活性检测结果表明,与对照组相比,MIR3960 mimics会导致Luci-TGFB2-OT1的活性有60%的下调,MIR4488 mimics会导致Luci-TGFB2-OT1的活性有40%的下调。在突变了与TGFB2-OT1的结合位点后,MIR3960和MIR4488 mimics均不能影响荧光素酶的活性。6. TGFB2-OT1通过结合MIR3960和MIR4488,调控靶蛋白CERS1和NAT8L的水平。6.1用MIR3960和MIR4488的mimics和inhibitor分别转染血管内皮细胞,结果发现与对照组相比,MIR3960和MIR4488的mimics可以分别下调CERS1和NAT8L的mRNA和蛋白水平。与此相反,MIR3960和MIR4488的inhibitor会明显上调CERS1和NAT8L的mRNA和蛋白水平。6.2分别将CERS1和NAT8L的3’UTR克隆到荧光素酶报告基因下,然后分别与MIR3960和MIR4488 mimics共同转染HEK293细胞。结果表明,MIR3960 mimics会明显降低Luc-CERS1-3’UTR的荧光素酶活性,而MIR4488 mimics会明显降低Luc-NAT8L-3’UTR的荧光素酶活性。6.3在血管内皮细胞中,用3BDO处理下调TGFB2-OT1的表达会明显抑制CERS1和NAT8L的mRNA和蛋白水平,而在HEK293细胞中过表达TGFB2-OT1会促进CERS1和NAT8L的蛋白水平。7. TGFB2-OT1通过MIR4459和LARP1调控蛋白合成和炎性反应。7.1在血管内皮细胞中,MIR4459 mimics的转染会下调LAPR1和SQSTM1的蛋白水平。7.2在血管内皮细胞中,用3BDO处理下调TGFB2-OT1的表达会明显抑制LARP1的mRNA和蛋白水平,而在HEK293细胞中过表达TGFB2-OT1会促进LARP1的蛋白水平。7.3 TGFB2-OT1的过表达会促进促进切割的Caspase 1水平和IL1B的mRNA水平,而3BDO处理会抑制IL1B的mRNA水平的上调。结论1.在炎性诱导因子LPS和oxLDL的作用下,NUPR1通过上调TIA1的蛋白水平来促进TGFB2-OT1的产生,表明NUPR1和TIA1参与调控TGFB2-OT1的表达。2. ANXA7通过与TIA1的相互作用,抑制TIA1的磷酸化,进而促进TGFB2-OT1的表达,表明ANXA7通过调控TIA1的磷酸化,与TIA1共同参与TGFB2-OT1表达调控。3. TGFB2-OT1作为竞争性内源RNA,通过结合MIR3960和MIR4488,上调靶基因CERS1和NAT8L的水平,促进自噬。4. TGFB2-OT1通过结合MIR4459,上调靶基因LARP1的水平,通过SQSTM1提高切割的CASP1以及IL1B的水平,促进炎症。