论文部分内容阅读
IE180基因（Immediate-early 180 gene）是伪狂犬病毒（PseudorabiesVirus，PRV）唯一的立即早期基因，对伪狂犬病毒在动物体内的复制是至关重要的。只有IE180基因开放转录并翻译成IE180蛋白，其下游的基因才能在IE180蛋白的激活作用下，得以完全的开放转录。如果在机体内将PRV IE180基因加以抑制，使之不能转录，则病毒的复制就不能完成。本研究首先提取了伪狂犬病毒鄂A株基因组DNA，通过BamHⅠ酶切，以pBluescriptⅡ SK（+）为载体，克隆了其4.8kbs的片段，该片段包含了IE180基因从起始密码子至终子密码子的所有4383bps的编码序列以及其启始密码子ATG前215bp的调控序列和TGA后269bps的加尾信号序列。采用XhoⅠ、NcoⅠ、SacⅠ等3种酶对克隆质粒进行酶切电泳分析，与预计片段相符，证明该片段确为IE180基因。由于伪狂犬病毒IE180基因的DNA与mRNA的碱基序列是共线性的（identical，coliner），也即IE180的DNA不存在任何内含子，据此设计了长度分别为2.0kb、0.50kb、0.28kb以及0.12kb的4个反义片段，分别位于-215--+1857，-186--+320，+1666--+1952，-106--+17位置，其中在O.50kb、0.28kb、0.12kb片段引物中分别加入XhoⅠ与XbaⅠ的酶切位点。通过克隆、亚克隆和PCR方式，将4个反义片段克隆至pCI-neo质粒，构建了4个反义质粒，即APCIE1.85、APCIE0.5、APCIE0.28、APCIE0.12。采用脂质体转染方法，用4个反义质粒转染培养的BHK-21细胞，经过G418的抗性筛选，获得了4个反义细胞系。抗性细胞扩大培养，收集细胞，采用改良一步法提取细胞的RNA，利用RT-PCR方法进行了反义RNA的检测。结果表明在4个反义细胞系中均有反义RNA的转录，说明反义质粒已完全整合入BHK-21细胞并已得到转录。通过测定病毒在各个反义细胞系中的TCID50，检测了反义RNA对病毒的抑制作用。4个反义质粒中以APCIE0.1效果最好，其对病毒的抑制程度达到了99.13％其它的抑制率分别为：APCIE0.28 92.41％、APCIE0.50 85.87％、APCIE1.85 89.77％。 通过细胞水平的分析，获得了对PRV抑制效果最好的反义片段，即APCIE0.12所包含的0.12kb的片段，该片段横跨激活蛋白区，包含了ATG位点，其反义RNA的生成有效抑制了PRV IE180基因的翻译，从而阻止了病毒的复制。 选择成年母鼠用PMSG及HCG对小鼠进行超数排卵处理，一定时间后从母鼠的输卵管中取出受精卵，透明质酸酶消化后，准备在显微操作仪F进行显微注射。APCIEO.12质粒经Bglll及BamHI酶切线性化后回收3.skbj佘段并纯化，微注射针吸入DNA液，将显微注射针插入受精卵的雄原核内，注入约3pl的DNA液，培养箱内短时间培养后，将形态正常的受精卵移入假孕母鼠的左右侧输卵管中，每侧移植5枚左右。共计产下38只转基因后代。剪取鼠尾，提取DNA，采用PCR方法检测外源片段的整合情况。经检测，有3只小鼠为阳性，提取鼠尾RNA，采用RT一PCR方法检测反义RNA表达，结果1号鼠没有检测到表达，而2号与3号鼠显示为阳性，同时经斑点杂交鉴定，2号与3号鼠显示为阳性。 采用10xLDS。（LD50二10一2·5/0 .lml）的PRv对转基因小鼠及对照鼠进行攻毒，其中一只比对照组多存活3天，另一只转基因鼠能够存活下来。结果表明导入小鼠体内的外源反义片段具有明显的抗病毒的能力，本研究为反义RNA在家畜上的应用提供较为详细的理论数据，也为生产抗伪狂犬病毒的转基因家畜提供了动物模型，并为家畜的抗病育种工作打下基础。