【摘 要】
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目的:本研究旨在对腺苷N6位的甲基化修饰（m6A）中关键阅读器分子YTHDF3（YTH N6-Methyladenosine RNA Binding Protein 3）在乳腺癌迁移侵袭及生长增殖中的恶性作用及m6A甲基化修饰对YTHDF3的影响进行初步探索。方法:（1）生物信息学筛选乳腺癌中关键m6A甲基化调控因子:采用多数据库多算法筛选有效预后分子靶点,通过Lasso（Least absolu
【基金项目】
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国家自然科学基金资助项目（81560481）；
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目的:本研究旨在对腺苷N6位的甲基化修饰（m6A）中关键阅读器分子YTHDF3（YTH N6-Methyladenosine RNA Binding Protein 3）在乳腺癌迁移侵袭及生长增殖中的恶性作用及m6A甲基化修饰对YTHDF3的影响进行初步探索。方法:（1）生物信息学筛选乳腺癌中关键m6A甲基化调控因子:采用多数据库多算法筛选有效预后分子靶点,通过Lasso（Least absolute shrinkage and selection operator）回归的方式建立预后回归模型,并通过单多因素Cox分析预后模型对临床指标相关性进行探讨其能否作为独立预后指标,随后利用log-Rank分析预后能力,最终得到YTHDF3作为乳腺癌中m6A甲基化修饰靶点进一步研究。（2）YTHDF3在乳腺癌及不同分子亚型乳腺癌细胞中的表达情况:通过实时荧光定量PCR（Realtime fluorescence quantitative PCR,RT-qPCR）及Western blot检测乳腺癌不同分子亚型及正常乳腺上皮细胞中YTHDF3的mRNA及蛋白表达情况。（3）采用 siRNA（Small interfering RNA）对MDA-MB-231、MCF-7两株乳腺癌细胞进行瞬时沉默YTHDF3,划痕实验观察YTHDF3对细胞创面愈合能力的影响。（4）构建YTHDF3稳定沉默、过表达YTHDF3、m6A结构域突变型MDA-MB-231、MCF-7细胞株,包括有稳转无义序列的（sh-NC组）、YTHDF3稳定敲低的shY3-1、shY3-2组,稳转空载质粒的Control组、YTHDF3过表达组（YTHDF3-WT）及m6A结构域突变的YTHDF3-Mut组。通过RT-qPCR或Western blot检测YTHDF3的表达情况,确定敲低、过表达及突变效率。（5）Trans well（小室）实验研究YTHDF3稳定沉默后对MDA-MB-231、MCF-7的迁移侵袭能力的影响,CCK-8（Cell Counting Kit-8）细胞活力测定及细胞克隆形成实验检测YTHDF3对乳腺癌细胞增殖生长的影响,并利用Western blot检测迁移侵袭相关蛋白表达。（6）Trans well实验研究YTHDF3过表达及YTHDF3中m6A结构域突变后对MDA-MB-231、MCF-7迁移侵袭能力的影响,CCK-8实验测定及细胞克隆形成实验检测YTHDF3的m6A结构域对乳腺癌细胞增殖生长的影响,并利用Western blot检测迁移侵袭相关蛋白表达。结果:（1）生物信息学筛选m6A甲基化调控因子共计17个,单因素Cox分析筛选共4个靶点分子（RBM15B、METTL16、YTHDF3和IGF2BP1）,并成功利用Lasso回归算法建立预后模型,多数据库比对分析后确定YTHDF3作为研究乳腺癌中m6A甲基化修饰的靶点分子。（2）组织化学染色确定YTHDF3在乳腺癌组织中较癌旁组织高表达,在乳腺癌不同亚型细胞系中除HER2+亚型外,均较乳腺正常上皮细胞表达升高。（3）成功构建YTHDF3稳定敲低、过表达及m6A结构域突变的MDA-MB-231、MCF-7细胞株,并构建无义序列及空载细胞系作为对照组。（4）瞬时沉默YTHDF3后,MDA-MB-231、MCF-7细胞系较瞬转无义序列的对照组创面愈合能力明显下降（P＜0.001）,稳定沉默YTHDF3后MDA-MB-231、MCF-7（shY3-1、shY3-2）较稳转无义序列的对照组（sh-NC）迁移侵袭及增殖生长能力下降（P＜0.05）,其迁移侵袭标志分子MMP-2、MMP-9蛋白表达明显下降（P＜0.05）。（5）YTHDF3过表达（YTHDF3-WT）与稳定转染空载质粒的对照组（Control）相比迁移侵袭,增殖生长能力明显增强（P＜0.05）。但是与m6A结构域突变细胞株（YTHDF3-Mut）相比迁移侵袭,增殖生长能力无差异（P＞0.05）。结论:（1）YTHDF3可以作为乳腺癌中m6A甲基化研究的有效切入点,具有良好的预后诊疗能力及分子靶点潜力。（2）YTHDF3作为恶性靶点影响乳腺癌细胞的迁移侵袭,增殖生长的恶性细胞功能学进程。（3）m6A甲基化在YTHDF3发挥主要功能,影响乳腺癌细胞的恶性生物功能学。
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