犬Ⅲ型干扰素的功能特点及B型流感病毒NEP蛋白出核功能研究

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在本研究中,首次对犬Ⅲ型干扰素的功能进行了详细的研究。基于核酸序列的系统进化分析表明,该犬Ⅲ型干扰素与猪IFN-λ1,蝙蝠IFN-λ1和人IFN-λ1自然的聚为一支,表明该犬Ⅲ型干扰素为IFN-λ1。将该IFN-λ1于大肠杆菌中进行了表达,纯化,并对纯化后的蛋白进行了功能研究。结果表明,该IFN-λ1在同种和异种细胞上均具有一定的抗病毒活性,包括VSV病毒、犬细小病毒和H1N1流感病毒等。研究还发现犬IFN-λ1在CMT肿瘤细胞和MDCK细胞上均具有抗增殖活性,且在CMT肿瘤细胞上的抗增殖活性更强。此外,犬IFN-λ1可以激活JAK-STAT信号传导系统。为了验证该犬IFN-λ1是否能诱导干扰素诱导基因的表达,我们还用实时荧光定量PCR的方法检测了犬IFN-λ1刺激MDCK细胞后的ISG15,Mx1和2’5’-OAS表达水平,结果表明,该三种干扰素诱导基因均被显著上调。我们还用同样的方法检测了VSV和流感病毒感染后的MDCK细胞中的IFN-λ1的mRNA水平,结果显示,与对照相比,IFN-λ1的mRNA水平也明显被上调。最后,本研究还通过ELISA的方法进行了犬IFN-λ1与其受体胞外域(IFNλR1-EC)的结合检测,结果显示,犬IFN-λ1能很好的与IFNλR1-EC进行结合。流感病毒的核输出蛋白(NEP蛋白)是病毒粒子中的结构蛋白,由病毒的第八个基因片段编码产生,在病毒的基因组复制与转录,病毒vRNP复合物的细胞核输出过程、病毒粒子的组装、出芽等多个环节发挥着重要作用。目前对B型流感病毒NEP蛋白核穿梭机制的研究还存在很多尚未解决的问题。本研究以BNEP为研究对象,发现了B型流感病毒NEP蛋白上存在三个NES,且都是CRM1依赖的。这三个NES在体内可与CRMl直接结合。这三个NES上的疏水性氨基酸对其功能的发挥都是至关重要的,三个NES共同介导了蛋白的出核。
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