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第一部分GRHL3和c-MYC在食管鳞癌组织中的表达及其临床意义目的:研究食管鳞癌(esophageal squamous cell cancer,ESCC)患者鳞癌组织及癌旁组织中转录因子GRHL3(Grainyhead-like 3,GRHL3)和c-MYC的表达情况,并在基因水平和蛋白水平分析GRHL3和c-MYC表达水平之间的关系,分析GRHL3和c-MYC与ESCC患者临床病理特征的关系。方法:1收集2015年6月至2016年9月在河北医科大学第四医院胸外科行肿瘤切除并经病理证实的64例ESCC患者的ESCC组织和癌旁组织,将每例标本分为2份,按下述两种方法处理:(1)置于液氮中,然后置于-80℃超低温冰箱中贮存以备提取RNA;(2)以4%甲醛溶液固定以备制作组织蜡块,用于免疫组化染色。2采用实时荧光定量聚合酶链式反应(quantificational real-time polymerase chain reaction,q RT-PCR)方法检测ESCC组织、癌旁组织中GRHL3和c-MYC m RNA的表达水平,在基因水平分析其相关性。3应用免疫组化方法检测ESCC组织、癌旁组织中GRHL3和c-MYC蛋白表达水平,并在蛋白水平分析其相关性。4分析ESCC组织内GRHL3和c-MYC蛋白表达水平与患者临床特征关系。结果:1 ESCC组织中GRHL3 m RNA的表达水平显著高于癌旁组织[(2.85±2.83)vs.(2.06±2.02),P<0.01],ESCC组织中c-MYC m RNA的表达水平显著高于癌旁组织(5.13±5.11 vs.2.03±2.00,P<0.01)。GRHL3与c-MYC m RNA的表达水平呈显著正相关关系(P<0.001)。2与癌旁组织相比,ESCC组织中GRHL3蛋白阳性表达水平均显著升高(81.30%vs.25.00%,P<0.001),ESCC组织中c-MYC蛋白阳性表达水平均显著升高(42.20%vs.20.30%,P<0.01)。ESCC组织中GRHL3蛋白表达和c-MYC蛋白表达呈显著正相关关系(P<0.001)。该结果表明在ESCC患者GRHL3和c-MYC表达在基因水平和蛋白水平上是一致的。3 ESCC组织中GRHL3蛋白表达情况与肿瘤分化程度、侵犯深度、淋巴结转移、临床分期相关(P<0.001;P=0.037;P=0.022;P=0.003),与患者性别、年龄无关(P=0.604;P=0.904);ESCC组织中c-MYC蛋白表达水平与肿瘤分化程度、侵犯深度、淋巴结转移、临床分期相关(P=0.019;P=0.023;P=0.005;P=0.001),与患者性别、年龄无关(P=0.403;P=0.747)。第二部分GRHL3对食管癌细胞恶性生物学行为的影响及其机制研究目的:研究GRHL3对食管鳞癌细胞恶性生物学行为的影响,并探讨相关机制。方法:1应用q RT-PCR方法检测GRHL3在TE13、TE1、KYSE30、Eca109和KYSE170五种食管鳞状细胞癌细胞株中的表达情况,筛选出GRHL3高表达的食管鳞癌细胞KYSE30。应用RNA干扰(RNA interference,RNAi)方法敲低GRHL3 m RNA的表达,分为干扰组(si-GRHL3组),阴性对照组(NC-GRHL3组)及空白对照组(Con组),经q RT-PCR和Western blot方法分别检测3组细胞GRHL3在基因和蛋白水平的表达情况。2应用MTS法、细胞克隆形成实验、细胞划痕实验和Transwell侵袭实验检测敲低GRHL3后KYSE30细胞增殖活性、迁移能力和侵袭能力的变化。3应用流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)检测敲低GRHL3后对KYSE30细胞细胞周期及凋亡的影响。4应用免疫印迹法(Western blot)检测敲低GRHL3后对KYSE30细胞迁移相关蛋白表达水平的影响。结果:1检测TE13、TE1、KYSE30、Eca109和KYSE170五种人食管鳞癌细胞株GRHL3 m RNA的表达水平,筛选出GRHL3表达水平最高的KYSE30细胞,用于后续实验。与NC-GRHL3组和Con组相比,si-GRHL3组KYSE30细胞中GRHL3基因和蛋白表达水平显著降低(P<0.05),说明已成功敲低GRHL3在KYSE30细胞中的表达。2细胞克隆形成实验、MTS法检测结果显示,敲低GRHL3能够抑制食管癌KYSE30细胞的克隆形成能力[(59.28士3.64)vs.(87.33士1.90)vs.(88.87士0.36),P<0.05]及增殖活性[(0.87士0.01)、(1.22士0.03)、(1.37士0.25)vs.(1.10士0.01)、(1.89士0.09)、(2.10士0.09)vs.(1.14士0.04)、(1.93士0.01)、(2.23士0.05),P<0.05)]。3细胞划痕实验结果显示,划痕12h和24h后,si-GRHL3组细胞迁移距离为(24.5±3.2 vs.55.4±4.8)μm,NC-GRHL3组细胞迁移距离为(59.3±3.6 vs.95.1±4.6)μm,Con组细胞迁移距离为(64.2±3.2 vs.92.3±3.5)μm。si-GRHL3组迁移距离在12h及24h后与NC-GRHL3组和Con组相比均明显缩短,差异有统计学意义(P<0.05),NC-GRHL3组和Con组相比无统计学意义(P>0.05),说明GRHL3能够影响KYSE30细胞的迁移能力。Transwell侵袭实验结果显示,si-GRHL3组、NC-GRHL3组和Con组穿膜细胞数分别为(50.26±4.37)vs.(120.00±4.01)vs.(129.38±5.20),si-GRHL3组穿膜细胞数较NC-GRHL3组和Con组均显著降低(P<0.05),两者穿膜细胞数无统计学意义(P>0.05),说明GRHL3敲低后能够抑制KYSE30细胞的侵袭能力。4流式细胞术结果显示:与NC-GRHL3组和Con组相比,si-GRHL3组细胞中DNA合成受到抑制,阻止si-GRHL3组细胞从G0/G1期进入S期,使G0/G1期百分比明显增加[(66.64士1.31)%vs.(56.53士2.15)%vs.(55.97士1.36)%,P<0.05]。敲低GRHL3后,si-GRHL3组KYSE30细胞的凋亡率与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。5 Western blot结果显示,敲低GRHL3能够促进E钙粘蛋白(E-cadherin,E-cad)的表达(P<0.05),降低N钙粘蛋白(N-cadherin,N-cad)的表达(P<0.05)。结论:1 ESCC患者组织中GRHL3和c-MYC呈高表达状态,与肿瘤分化程度、侵犯深度、淋巴结转移、临床病理分期相关,与患者性别、年龄无关。2通过RNA干扰实验证明GRHL3通过影响食管癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力及EMT促进食管癌的发生发展。