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乳腺癌是全球女性中最常见的癌症,也是女性癌症死亡的主要原因。目前,乳腺X线摄影术是诊断乳腺癌的常用技术,却因患者年龄和乳腺组织密度的差异不能在人群中普及。肿瘤相关自身抗体作为一种血清学标志物受到很多学者的青睐。然而,大多数研究采用常规的间接ELISA法仍未发现对乳腺癌具有较高诊断潜力的自身抗体标志物或自身抗体谱。目的本研究旨在采用一种相对定量的间接ELISA法评估p53,cyclin B1,cyclin D1,p16,IMP1,p62,koc,c-myc,survivin,14-3-3ξ和RalA 11种肿瘤相关自身抗体的检测对乳腺癌免疫诊断的价值,并建立一个对乳腺癌具有更高诊断潜力的自身抗体组合。方法1.采用大肠杆菌原核表达系统和pET-28a(+)表达质粒诱导表达6×组氨酸标记的p53,p62,14-3-3ξ和RalA四种重组蛋白,并通过镍柱亲和层析法纯化蛋白。2.按照诊断实验评价样本含量的估计方法用PASS13.0软件估算所需样本量。本研究共收集415份血清,包括197例乳腺癌患者的血清,109例乳腺良性疾病患者的血清和109例正常人的血清。3.采用间接ELISA法检测血清中自身抗体的含量,并在其基础上加入梯度稀释的Ig G标准品,用以制作标准曲线从而标准化ELISA实验结果,此种方法被称为相对定量ELISA法。通过免疫印迹试验对ELISA实验结果进行验证。4.采用单因素方差分析和SNK法比较各组间自身抗体相对含量是否相同;采用卡方检验比较自身抗体在乳腺癌组与对照组中阳性率的差异。采用诊断试验的评价方法,对单个自身抗体检测乳腺癌以及多个自身抗体并联检测乳腺癌的诊断真实性和可靠性进行评估。采用Kruskal-Wallis检验分析各个自身抗体在不同临床分期患者中的含量是否有差异。结果1.本研究成功纯化出了p53,p62,14-3-3ξ和RalA四种重组蛋白,浓度分别为0.24 mg/ml,0.19mg/ml,0.76mg/ml和0.50mg/ml,四种蛋白的纯度较高。2.p53,cyclin B1,p16,p62,c-myc,survivin和14-3-3ξ自身抗体在乳腺癌组的阳性率显著高于乳腺良性疾病组(P<0.05)和正常对照组(P<0.01)。其中,灵敏度最高的是cyclin B1自身抗体,其灵敏度为23.9%,其次为抗survivin抗体(19.3%)和p53(15.6%)自身抗体。抗14-3-3ξ抗体对乳腺癌也具有一定的诊断价值,灵敏度为14.7%。3.并联检测多种自身抗体时,随着检测指标的增加,所得自身抗体组合反应的灵敏度从23.9%升高至62.4%。自身抗体组合的受试者工作特征曲线下面积为0.78。4.Ⅰ期乳腺癌患者血清中p16自身抗体含量明显高于其它各期的乳腺癌患者(P<0.01)。结论1.p53,cyclin B1,p16,p62,c-myc,survivin和14-3-3ξ相应的自身抗体是乳腺癌诊断的潜在标志物。其中,p16自身抗体是乳腺癌早期诊断标志物;2.单个自身抗体检测乳腺癌灵敏度较低,多个自身抗体并联检测可提高对乳腺癌诊断的灵敏度。3.联合检测p53,cyclin B1,p16,p62,c-myc,survivin和14-3-3ξ相应的自身抗体对乳腺癌具有一定的免疫诊断价值。