阿尔茨海默病(Alzheimers disease，AD)是一种以进行性的记忆丧失、意识障碍及人格变化为临床特征的中枢神经系统退行性疾病，也是最常见的一种老年痴呆。因此，以Aβ为靶的免疫治疗方法成为AD研究的热点。 1999年Schenk等人首次用Aβ42全肽疫苗免疫接种AD转基因小鼠(PDAPP)试图以免疫的方法来治疗AD。研究结果表明，疫苗接种不仅可以清除PDAPP小鼠脑内已经形成的老年斑，而且还可以明显改善APP+PS1和TgCRND8转基因小鼠的认知功能。本室在前期的研究中成功制备了Aβ42肽疫苗及MAPs-Aβ1-15肽疫苗，并在SD大鼠、BALB/C小鼠、Tg2576小鼠及恒河猴体内试验发现其具有良好的免疫原性。虽然如此，但仍有许多不尽人意的地方：1)研究者们制备的抗原大多为化学合成，合成肽的化学修饰难度大，成本高，而且纯度不高。2)研究者们在制备含有AβN末端B细胞抗原表位的多价疫苗时，大多是将B细胞抗原表位片段直接与一个新的T细胞表位连接，或者B细胞抗原表位直接串联，容易影响抗原的空间结构，不利于Aβ的B细胞抗原表位的暴露。3)很少对免疫原引起的T细胞反应进行研究。鉴于以上因素，在本室前期制备的Aβ1-15 DNA疫苗的基础上，本课题拟制备以柔性肽串联4个Aβ1-15为免疫原、以粒．巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte/macrophage-colony stimulating factor，GM-CSF)为基因佐剂、以腺病毒为载体的共表达基因疫苗Ad-4×Aβ15，同时以共表达Aβ42及GM-CSF的腺病毒疫苗Ad-Aβ42和仅表达GM-CSF的腺病毒疫苗Ad-GMCSF为对照。免疫接种野生型C57BL/6鼠及Tg2576 AD转基因小鼠，观察其体液和细胞免疫治疗效应，探讨重组四价Aβ1-15腺病毒AD疫苗应用于防治AD的潜在可能性，为重组四价Aβ1-15腺病毒疫苗的临床应用提供实验依据。 材料和方法： 1 Ad-4×Aβ15疫苗的制备以本室保存的含有小鼠IgG κ(轻链信号肽序列和甘氨酸-丝氨酸串联4个Aβ1-15的重组质粒pcDNA3.1-s4×Aβ15为模板酶切出带有信号肽的4×Aβ15、RT-PCR法从conA刺激培养的小鼠脾脏细胞中扩增的小鼠GM-CSF基因以及从Clontech公司载体pIRES2-EGFP中扩增的IRES基因，三者依次亚克隆入pAdTrack-CMV质粒中产生pAdTrack-4×Aβ15-IRES-GMCSF重组穿梭载体。利用pAdEasy系统，当pAdTrack-4×Aβ15-IRES-GMCSF穿梭载体在大肠杆菌BJ5183中与腺病毒骨架载体pAdEasy-1发生同源重组后，提取阳性重组子。 2 Ad-4×Aβ15疫苗接种C57BL/6鼠的体液免疫效应观察为了确证重组腺病毒疫苗能否诱导机体产生特异性的抗Aβ42抗体反应，Ad-4×Aβ15、Ad-Aβ42及Ad-GMCSF三种病毒通过鼻黏膜接种6～8周野生型C57BL/6小鼠，每3周一次，每次用量1×108 PFU，一共持续接种3个月，接种前、接种后6周和12周通过尾静脉取血约150 μL。间接ELISA法检测小鼠血清中抗Aβ42抗体的水平；Western blot方法检测血清抗Aβ42抗体的特异性。 3 Ad-4×Aβ15疫苗接种Tg2576鼠的体液免疫及细胞免疫效应观察Ad-4×Aβ15、Ad-Aβ42及Ad-GMCSF三种病毒通过鼻黏膜接种12月龄Tg2576转基因鼠，每3周一次，每次用量1×108PFU，一共持续接种7个月，每次接种后两周通过尾静脉取血约150 μL。间接ELISA法检测小鼠血清中抗Aβ42抗体的水平；ELISA桥联法检测血清抗Aβ42 IgG亚类。 最后一次免疫后2周，心脏采血，分离脾脏细胞，分别用重组表达的4×Aβ15和化学合成的Aβ40肽刺激培养的脾脏细胞。3H-TDR法测定4×Aβ15和Aβ40肽刺激对淋巴细胞的增殖作用；ELISA双抗体夹心法检测4×Aβ15和Aβ40肽刺激后培养液中IFN-γ和IL-4的水平；ELISPOT法测定4×Aβ15和Aβ40肽刺激后分泌IFN-γ和IL-4的细胞数目。 结果： 1 Ad-4×Aβ15疫苗的制备制备的重组腺病毒通过CMV启动子引导下的IRES顺反子表达盒能同时表达Aβ及GM-CSF基因，RT-PCR显示感染的HEK293A中有各自目的基因的mRNA转录。 2 Ad-4×Aβ15疫苗接种C57BL/6鼠的体液免疫效应观察Ad-4×Aβ15、Ad-Aβ42均诱导C57BL/6鼠产生了高滴度的Aβ特异性的抗体，而Ad-GMCSF未能诱导抗体的产生。免疫接种结束后，Ad-4×Aβ15组小鼠抗体滴度达到53.31±15.28 μg/ml，Ad-Aβ42组达到78.37±21.81 μg/ml。Western blot方法检测血清中抗Aβ42抗体能与原核表达的GST-Aβ42融合蛋白特异性结合。 3 Ad-4×Aβ15疫苗接种Tg2576鼠的体液免疫及细胞免疫效应观察随着接种次数的增加，Ad-4×Aβ15、Ad-Aβ42组小鼠血清抗体滴度逐渐上升，到第10次接种后基本达到平台，滴度不再上升。到最后一次接种后滴度分别达到117.9±22.14 μg/ml和136.36±21.62 μg/ml，两者之间没有统计学差别(P＞0.05)，而且抗体水平的变化趋势相同。Ad-GMCSF组抗体水平维持在基线水平。 4 Ad-4×Aβ15疫苗接种Tg2576鼠改善认知退化及病理变化实验和安全性评估Morris水迷宫行为学测试结果显示，在定位航行实验的第3-4天，Ad-4×Aβ15和Ad-Aβ42组平均逃避潜伏期明显较Ad-GMCSF组短(P＜0.01)。在空间探索实验穿过平台的次数、平台象限游泳时间的百分比方面，Ad-4×Aβ15和Ad-Aβ42组均比Ad-GMCSF组多，差异有统计学意义(P＜0.01)，Ad-4×Aβ15组和Ad-Aβ42组相比，差异不具有统计学意义(P＞0.05)。 实验期间，各组转基因小鼠外观正常；饮食无明显变化；毛发无脱落；精神状态好；意识清醒；四肢运动正常；免疫部位未见明显炎症反应。 疫苗接种后，各组转基因小鼠的脑、肝和肾未见组织结构的病理损害；Perls呈阴性反应，表明疫苗接种未导致小鼠出现脑出血。 结论： 1.成功制备出高滴度Ad-4×Aβ15疫苗及Ad-Aβ42 AD疫苗，通过克隆入的IRES顺反子表达盒能同时分泌性共表达Aβ及GM-CSF基因。 2.Ad-4×Aβ15和Ad-Aβ42疫苗均能诱导C57BL/6鼠和Tg2576转基因小鼠产生高滴度Aβ特异性的抗体。 3.和Ad-Aβ42疫苗相比，Ad-4×Aβ15疫苗能诱导机体产生更向Th2方向极化的免疫反应。从而可能避免出现Th1细胞极化优势的细胞免疫应答所引起的不良反应。 4.Ad-4×Aβ15疫苗没有诱导机体产生针对Aβ42特异性的T细胞反应。4×Aβ15含有新的T细胞表位，但不含有Aβ的T细胞表位。 5.Ad-4×Aβ15疫苗接种Tg2576鼠明显改善了其认知退化及病理变化。Ad-4×Aβ15和Ad-Aβ42组行为学均比对照Ad-GMCSF组明显改善。同时，Ad-4×Aβ15组和Ad-Aβ42组小鼠相关脑区淀粉样沉积斑块面积明显减少。 6.Ad-4×Aβ15和Ad-Aβ42组小鼠均出现了脑内Ap沉积减少，血浆Aβ含量增加，推测外周沉降机制可能为抗体清除脑内Aβ沉积的一种作用机制。 7.Ad-4×Aβ15疫苗具有良好的安全性。疫苗接种Tg2576小鼠后，未见出现明显的局部反应，脑、肝和肾脏的形态及功能未出现损伤或损害，脑内没有出血发生。