大肠杆菌因为遗传背景清楚,代时短,易控制成为生产重组蛋白的主要工程菌。目前在利用原核系统表达重组蛋白的过程中常常遇到几个难题是重组蛋白常常以包含体的形式存在、表达量低、生物活性不高和容易降解等。高度还原性的大肠杆菌细胞质环境使表达的重组蛋白不易形成正确的二硫键和完整的四级结构,真核来源的功能蛋白或细胞因子常因原核表达系统的局限性而不能得到类似天然活性的重组蛋白。大肠杆菌自身二硫键的形成都是在其具有氧化性环境的周质腔进行的,大肠杆菌周质腔内二硫键形成蛋白家族成员是大肠杆菌自身蛋白形成正确二硫键的关键因素,它们一级结构都含有活性位点Cys-X-X-Cys,只是中间的氨基酸组成不同。二硫键形成蛋白A（Disulfide bond formation protein A ,DsbA）直接参与二硫键的形成,是迄今所发现的硫氧还蛋白家族中氧化性最强的一个,在体内和体外DsbA均能协助蛋白质折叠。DsbA的突变体DsbA^mut蛋白（DsbA mutant protein）是将DsbA的功能区域Cys-Pro-His-Cys中的两个Cys定点突变为Ser,构成Ser-Pro-His-Ser结构,突变后的DsbA蛋白即DsbA^mut蛋白不再具有氧化还原酶的功能,但仍然具有促目的蛋白可溶和细胞定位的作用。本课题基于DsbA和DsbA^mut蛋白结构和性质特点,对它们在原核表达系统上的作用进行系统研究。我们首先以人神经生长因子（hNGF）作为目标蛋白,比较了几种硫氧还蛋白家族蛋白成员在融合蛋白共复性上作用,发现相对于Trx和DsbC而言,DsbA蛋白在促进hNGF折叠和维持其生物活性上更具有优势作用。接下来,我们在寻找可以促使hNGF原核细胞质可溶性表达融合伴体研究上,发现极少数融合伴体能促使hNGF原核表达可溶性形式,但将DsbA和DsbA^mut蛋白串联形成DsbA-DsbA^mut融合蛋白作为融合伴体时获得了hNGF原核可溶性的融合表达,并且获得的重组蛋白DsbA-DsbA^mut-hNGF是具有良好生物活性功能。鉴于DsbA-DsbA^mut融合蛋白在原核表达上特点和作用,我们构建了一种新型高效融合表达载体(pET-dsbA-dsbA^mut),并以此载体实现了多个真核来源的功能蛋白原核可溶性的融合表达,生物活性测定实验证实,DsbA-DsbA^mut融合蛋白可以促进目的蛋白的空间折叠并维持目的蛋白的天然活性,因此我们所构建的融合表达载体在表达真核活性蛋白上具有通用性。由于构建的融合表达载体表达的融合蛋白可以保持目的蛋白的空间折叠状态,因此利用此载体可以进行蛋白质的结构和功能研究。我们以此融合载体为平台,表达了9个hNGF突变体蛋白,生物活性测定实验发现,当删除hNGF的N末端或C末端的多个氨基酸时,其天然生物活性显著降低或丢失。由于DsbA-DsbA^mut融合蛋白与目的蛋白融合表达还需要进一步的切割,为了便于下游目的蛋白的分离纯化,我们又尝试了利用DsbA-DsbA^mut融合蛋白与目的蛋白hNGF在原核系统的共表达。目前结果表明,在原核系统共表达hNGF尚有困难。为了进一步探索DsbA蛋白家族在原核系统共表达的可能性,我们又尝试将DsbA蛋白与其家族另一成员DsbC融合,并作为伴侣分子与目的基因hNGF在原核系统共表达。结果表明,将DsbA-DsbC融合蛋白与hNGF在原核表达系统内以单质粒双启动子模式进行共表达,获得了hNGF原核细胞质可溶性表达。而单独的DsbA或DsbC蛋白没有这种作用。通过本课题的研究,我们根据DsbA和DsbA^mut蛋白的性质特点获得了一种原核通用融合表达载体,该载体在表达真核来源的活性蛋白或细胞因子具有促可溶和保持目的蛋白天然活性的功能。其次,利用该融合表达载体可以应用于蛋白质结构和功能研究。另外,我们以DsbA-DsbC融合蛋白与hNGF在原核表达系统内共表达,第一次实现了重组hNGF原核细胞质可溶性表达,这种共表达模式在表达其它蛋白尤其是那些含有多个二硫键的功能蛋白上具有潜在参考价值。