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由番茄黄化曲叶病毒(Tomato Yellow Leaf Curl Virus,TYLCV)引起的番茄黄化曲叶病毒病是近年来危害番茄安全生产的灾难性病害之一。传统的化学抗病毒剂防效低、易污染环境且易引发食品安全问题。作者所在实验室筛选到植物源抗病毒剂丁香酚,室内盆栽药效实验结果显示其对TYLCV的防效高达75.8%,远高于目前普遍使用的化学抗病毒剂盐酸吗啉胍;丁香酚处理能显著抑制病毒增殖、致病相关基因(CP、Rep、REn)在番茄体内的表达,并有效缓解病症。为了研究丁香酚抗TYLCV侵染的作用机制,本文克隆了番茄体内特异性抗TYLCV的抗病相关基因LePer1,并初步研究了丁香酚通过调控LePer1抗TYLCV的作用机理。 第一,研究丁香酚如何调控LePer1的表达。水杨酸(SA)和一氧化氮(NO)都是植物免疫反应过程中的重要信号分子。RT-PCR结果显示SA和外源NO供体硝普钠(SNP)处理均能诱导LePer1的表达。通过NO特异性荧光探针(DAF-FMDA)对番茄幼苗内源NO的原位检测发现,丁香酚处理能刺激番茄幼苗根和茎中NO的产生,说明NO介导了丁香酚诱导LePer1的表达。结合本实验室的前期研究结果,即丁香酚能够促进植物体内SA的合成,说明丁香酚亦能通过SA诱导LePer1表达。而在植物免疫反应过程中,SA能够促进NO产生,即NO可以作为SA的下游信号发挥作用。由此,可以推论:丁香酚可能通过促进SA的合成,进而诱导NO的产生,最后NO诱导LePer1的表达,即“丁香酚→SA→NO→LePer1”线性信号途径。另外,其它激素处理(如茉莉酸、赤霉酸等)亦能诱导LePer1的表达,说明LePer1是植物激素介导的多条免疫途径的下游靶标,但丁香酚是否能通过调控其它激素免疫途径诱导LePer1表达需要进一步研究。 第二,LePer1基因的克隆及其结构与功能的预测分析。通过分段克隆、测序、拼接得到番茄体内LePer1的完整cDNA的核酸序列(1862 bp),由基因组序列中14个外显子组成。通过多重比对分析,发现LePer1在植物中的保守性较高。通过对其编码的氨基酸组成、疏水性和细胞定位预测,表明LePer1是一个细胞质膜蛋白。通过对跨膜结构和保守性结构域分析、并进行同源建模预测3D结构,确认LePer1蛋白是一种透性酶,可能具有转运核苷、酰脲和抗坏血酸等的功能。LePer1氨基酸序列的蛋白修饰位点预测显示其含有多个磷酸化和豆蔻酰化位点,表明LePer1还可能参与激酶介导的信号传导,但LePer1在植物免疫的具体功能下游调控事件还需要通过转基因手段进一步鉴定。