中药白及为兰科植物白及Bletilla striata（Thunb.）Reichb.f.的干燥块茎。具有收敛止血,消肿生肌之功效。用于咯血,吐血,外伤出血,疮疡肿毒,皮肤皲裂^[1]。白及收敛止血、消肿生肌功效显著,近年来更随着应用范围不断扩大,用量不断增加,而白及资源遭自然及人为因素破坏,人们对白及的狂采滥挖导致其野生资源已近枯竭,造成市面上供不应求,受白及植株繁殖困难影响,人工栽培白及还未能改善这一现状,导致白及价格居高不下,市场上充斥大量混伪品^[2]。白及属在我国共有4个种,同属植物黄花白及（Bletilla ochracea Schltr.）收录于四川^[3]、甘肃^[4]等地方药材标准,小白及（Bletilla formosana（Hayata）Schltr.）和华白及（Bletilla sinensis（Rolfe）Schltr.）在贵州、云南等地为常用习用药,3种药材因与白及的外观形状差异很小,目前市场上有许多将这3种药材混入或者直接当作白及出售^[5]。从本文市场调查及样品收集鉴定结果来看,目前白及传统混伪品如射干、知母、冰球子等药材混用的情况未出现,市场上以黄花白及充当白及售卖的情况居多,二者外观性状极相似,从外观性状很难鉴别二者,导致目前白及药材市场情况十分混乱。因此准确鉴别白及与黄花白及、小白及以及其他混伪品对白及药材质量控制以及规范白及药材市场具有重要影响。目前《中国药典》2015版一部白及项下以外观性状和对照药材薄层色谱为指标进行药材鉴别,没有含量测定、指纹图谱等质量控制项目,而只依靠外观性状和薄层色谱不能全面控制白及药材质量,因此建立完整的白及药材化学成分含量测定及指纹图谱方法研究显得尤为重要。“丸、散、膏、丹,神仙难辨”,中药粉碎成粉末后其原有的外观性状特征全部消失,很难鉴定粉末饮片的真伪,更有在粉末饮片中以面粉或其他外观颜色类似的药材粉末进行混合掺伪等质量问题就更突出了,因此如何快速准确地鉴定粉末饮片真伪极其重要。因此,本文主要采用DNA条形码技术对白及进行物准确鉴定,为白及药材鉴定提供参考;建立了白及中多糖、1,4-二[4-（葡萄糖氧）苄基]-2-异丁基苹果酸酯（militarine）含量测定方法,并对白及70%乙醇部位指纹图谱进行方法研究,为白及药材多指标化、全面化质量控制提供参考;运用近红外光谱技术建立白及粉末定性鉴别模型,为解决粉末饮片鉴定真伪、掺假等问题提供参考;同时本文采用酪氨酸酶法及DPPH法对白及不同提取液的美白、抗氧化活性进行评价,同时对其活性部位制备工艺进行考察,为白及综合开发利用提供参考。本文主要研究内容如下:1.商品药材收集与鉴定本文对成都、贵阳、六盘水等地药材市场、白及药材种植地以及白及粉末饮片市场情况做了调查分析,同时对本文所收集的白及、黄花白及、小白及样品的外观性状包括外形、色泽、断面、质地及显微特征包括表皮细胞、纤维束、草酸钙针晶、导管及淀粉粒等特征进行鉴别分析,结果表明,白及与黄花白及、小白及在外观性状与显微特征上差异不大,对样品不能进行准确鉴定,需结合下一步DNA条形码进行准确鉴定。通过药材市场调查并收集样品,经DNA条形码鉴定共收集到白及药材18批,黄花白及11批,小白及1批,调查发现目前市场上白及统货规格中药材外形个头较大、较饱满的很少,大部分个头较小;甚至一些药材瘦小干枯、纤维性重,白及药材应该有的如同心环纹、分叉、黏性强等外观性状特征也很难看到。通过对四川省成都、都江堰、阿坝、彭州等地进行实地考察发现,白及野生资源已较少,之前野生资源较丰富的雅安、阿坝地区也很难见到。从四川太星药业白及种植基地、私人小型中药材种苗公司以及农户自种处收集的白及药材经过DNA条形码鉴定共收集黄花白及8批、小白及2批,未收集到白及样品,由此发现,除四川太星药业白及种植基地鉴定为药典收载品种白及Bletilla striata（Thunb.）Reichb.f.,其他私人小型中药材种苗公司或农户自种的白及均鉴定为黄花白及Bletilla ochracea Schltr.或小白及Bletilla formosana（Hayata）Schltr.,由此可见,白及药材在种植源头就已出现基源错误的问题,这应该引起足够的重视。2.DNA条形码鉴定研究本研究收集了白及以及黄花白及、小白及共40个样,并从Gen Bank下载了三者和华白及以及白及常见混伪品独蒜兰、竹叶兰、舌苞兰等的ITS2序列33条,采用DNA条形码ITS2序列片段,对白及及其混伪品进行分子生物学鉴定,白及的ITS2条形码序列长度为259bp,白及与小白及、黄花白及之间的亲缘关系最近,二者种间距离均在白及种内距离范围内,而与华白及、竹叶兰、舌苞兰、独蒜兰之间的最小种间距离均大于白及种内最大距离,表明单从遗传距离来看只能鉴别出白及属与华白及、竹叶兰、舌苞兰、独蒜兰等其他科属物种,区分不开白及属内3个物种;在基于邻接法构建的系统聚类树中,除华白及外,白及属其他3个种表现出了单系性,而同时又与其他科属混伪品明显区分开,鉴别结果与遗传距离结果一致;结合ITS2序列二级结构进一步鉴定可看出,白及、小白及的ITS2序列二级结构较相似,因Ⅲ号螺旋臂上小颈环的位置及数量不同而能够准确鉴定白及与小白及,而竹叶兰、苞舌兰及黄花白及、华白及与白及的二级结构差异较大,主要在颈环数、大小、角度及位置上存在显著区别。因此采用ITS2序列,结合ITS2序列二级结构,可将白及属的各个种及其他科属混伪品准确地鉴别出来。3.含量测定方法研究现行《中国药典》2015年版一部白及项下还未制定含量测定,不能很好的控制白及药材质量,多糖是白及药材中主要化学成分,具有止血、促进创面愈合、抗菌等作用^[37]。因此本文采用苯酚-硫酸法对白及中多糖进行含量测定,通过对显色条件以及供试品制备方法进行考察及验证,建立了用于白及多糖含量测定的方法。对白及和黄花白及、小白及中多糖进行含量测定,结果发现,白及中多糖含量在10.651%⁷5.310%之间,平均含量为58.028%;黄花白及多糖含量在13.947%⁷5.280%之间,平均含量为49.852%。二者多糖含量范围相近,差异不明显。1,4-二[4-（葡萄糖氧）苄基]-2-异丁基苹果酸酯（militarine）为白及中含量较高的成分,具有益智和延缓衰老、防治老年痴呆的功能^[43]。本文以HPLC建立了白及中1,4-二[4-（葡萄糖氧）苄基]-2-异丁基苹果酸酯（militarine）含量测定的方法。含量测定结果表明,白及中苹果酸酯含量在0.049⁷.06%之间,平均含量为2.135%;黄花白及中苹果酸酯含量在0.008⁷.496%,平均含量为3.443%。二者苹果酸酯含量相近,差异较小。4.指纹图谱方法研究针对以多糖和苹果酸酯未能区分白及与黄花白及,继而本研究采用UPLC指纹图谱,结合相似度评价、系统聚类分析及主成分分析,对白及与黄花白及、小白及指纹图谱进行分析。本文采用UPLC建立白及指纹图谱分析方法,对白及样品的70%乙醇提取物进行指纹图谱研究及比较。采用“中药指纹图谱相似度评价软件（2004 A版）”,中位数法建立14批白及药材的特征指纹图谱,共得到15个共有峰。对14批白及药材指纹图谱进行相似度评价,结果除样品S3为0.865,其他13批样品与对照指纹图谱间的相似度均>0.9。同时采用“中药指纹图谱相似度评价软件（2004 A版）”,将白及与黄花白及、小白及色谱图进行比较。结果色谱比较及聚类分析、主成分分析均不能将白及与黄花白及、小白及区分开,与图谱比对结果相一致。由此可知,以UPLC指纹图谱不能将白及与黄花白及、小白及鉴别。5.近红外光谱技术对白及粉末饮片的快速检测“丸、散、膏、丹,神仙难辨”,中药粉碎成粉末后其原有的外观性状特征全部消失,很难鉴定粉末饮片的真伪,更有在粉末饮片中以面粉或其他外观颜色类似的药材粉末进行混合掺伪等质量问题就更突出了,因此如何快速准确地鉴定粉末饮片真伪极为重要。本文采用近红外光谱技术分别建立白及与黄花白及、小白及定性鉴别模型（简称模型1）以及面粉、红薯粉或其他外观颜色相似的药材粉末等混入样品与白及粉末的定性鉴别模型（简称模型2）。模型1选取建模波段为4400-4800,5400-6600,7800-10000cm^-1为建模波段,通过9点卷积求导（dg2）和标准正交变量变换（SNV）对光谱进行预处理后,采用聚类分析方法（Cluster）建立模型1能够将白及与黄花白及、小白及很好的区分开,并且内部验证准确率高达100%,外部验证准确率达到90%。模型2选取建模波段为5400-6600,7800-10000 cm^-1,通过二阶导数加5点三阶泰勒求导（ds2）和标准正交变量变换（SNV）对光谱进行预处理,采用聚类分析方法（Cluster）建立的模型2能够将白及与面粉、红薯粉等掺伪粉或其他外观颜色相似的混伪品药材粉末等混入的样品完全区分开,并且内部验证和外部验证准确率均高达100%。6.酪氨酸酶抑制率及DPPH自由基清除率活性评价研究本文采用酪氨酸酶法及DPPH法对白及不同提取液的美白、抗氧化活性进行研究发现,白及醇提物对酪氨酸酶抑制率及DPPH自由基的清除率与阳性对照熊果苷及没食子酸相当,结果与文献^[11]一致。以酪氨酸酶抑制率及DPPH自由基的清除率为指标,对醇提浓度及制备工艺进行考察,结果以95%乙醇用量为100倍,提取时间为2h,共提取1次,所得提取物的酪氨酸酶抑制率及DPPH自由基清除率较高。为白及综合开发利用提供参考。