论文部分内容阅读
绿僵菌素A(Destruxin A,DA)是由金龟子绿僵菌Metarhizium anisopliae产生的一种六元环羧肽类毒素,对昆虫有胃毒、触杀和拒食等作用,能作用于昆虫的免疫系统,抑制昆虫的先天免疫作用,但其作用的分子靶标尚不清楚。本课题组前期根据药物亲和反应靶稳定性(drug affinity responsive target stability,DARTS)原理,从DA处理的家蚕(Bombyx mori)Bm12细胞中分离鉴定了近百种疑似DA结合蛋白,本论文选取其中4种蛋白,研究其与DA的互作关系,主要结果如下:(1)DA与蛋白的模拟分子对接使用MOE 2014分子操作软件(Chemical Computing Group,Montreal,Canada,http://www.chemcomp.com/)对候选蛋白进行同源建模及其与DA的分子对接分析,结果表明,DA与BmPiwi、BmTudor-sn、BmAGO2及BmPPI蛋白的对接结合自由能分别为-10.8577、-11.002、-9.1947和-8.1206 kcal/mol,DA与上述蛋白均能通过氢键结合,存在互作亲和性。(2)蛋白的异源表达与分离纯化克隆了BmPiwi、BmTudor-sn和BmAGO2蛋白的基因,将其连接到pEASY载体和pFast-Bac1载体,构建了昆虫杆状病毒真核表达系统,成功在草地贪夜蛾Sf9细胞中表达了上述蛋白,并经镍柱亲和层析分离纯化得到了重组蛋白。(3)生物膜干涉法(BLI)测定DA与蛋白的相互作用DA与BmTudor-sn蛋白存在互作亲和性,根据BLI互作曲线图和动力学参数,DA在125μmol/L、250μmol/L和500μmol/L呈浓度依赖性与BmTudor-sn蛋白结合,亲和力常数K_D约为491μmol/L。但是,DA仅在高浓度条件下才与BmPiwi蛋白互作,说明二者互作较弱;同时,BLI结果表明,DA与BmAGO2蛋白不存在互作或在互作的临界点附近。因为BLI要求供试蛋白的质量很高,本实验通过昆虫细胞表达并分离纯化的3种蛋白具有较高的含盐量,可能存在一定误差,因此,我们进一步采用昆虫双杂交法(Insect two-hybrid,I2H)验证了DA与蛋白的相互作用。(4)昆虫双杂法(I2H)验证DA与蛋白的相互作用分别构建了昆虫双杂载体PIE-目的蛋白-AD、PIE-互作蛋白-DBD,与PIE-Luc载体一起共同转染Sf9细胞,检查对比转染细胞的发光强度变化,结果发现,DA以剂量依赖方式引起处理转染细胞发光值变化,当DA在0.2、2μg/mL浓度处理下,DA对BmPiwi-BmHp1a、BmTudor-sn-BmAGO1和BmAGO2-BmDicer2的互作产生了较强的影响(相对发光率降低),且3对蛋白之间的差异不显著;而在0.02μg/mL浓度下,DA对3对蛋白的互作影响较弱(相对发光率高),但对BmTudor-sn-BmAGO1的影响最显著;在0.002μg/mL的浓度时,DA对3对蛋白的影响微弱(相对发光率较高),仍然是DA对BmTudor-sn-BmAGO1的影响最大。进而,应用氨基酸点突变技术构建了上述三种蛋白的突变体,通过I2H方法考察了DA对突变蛋白互作的影响,结果发现,当DA在0.02μg/mL浓度处理转染细胞时,突变体Cys614Ala、Lys649Ala及Lys875Ala与野生型BmPiwi蛋白相比,发光值显著变化,说明614位的半胱氨酸(Cys614)、649位与875位的赖氨酸可能是BmPiwi蛋白与DA结合的关键位点氨基酸。另外,当DA在0.02μg/mL浓度DA处理下,引起BmTudor突变体Leu704Ala及Ser707Ala的发光值显著改变,说明704位的亮氨酸(Leu704)与707位的丝氨酸(Ser707)是BmTudor与DA结合的关键位点氨基酸。同时,使用I2H方法对比研究了DA与二种免疫抑制剂-环孢素(CsA)和FK506对家蚕与人亲环蛋白(BmPPI与HsPPIA)的影响,结果发现,BmPPI与HsPPIA蛋白可与DA、CsA及FK506互作,从另一方面再次证明DA具有免疫抑制作用。