背景血小板是哺乳动物血液中的有形成分之一,是从骨髓成熟的巨核细胞胞质裂解脱落下来的具有生物活性的小块胞质,体积小,无细胞核。血小板主要发挥凝血、止血以及修补破损血管的功能,临床上血小板用于血小板数量减少或血小板功能障碍患者的救治。国际上通用的保存方式是在22±2℃条件下振荡保存,保存时间最多不超过7天,我国的血站技术操作规程(2012版)规定血小板保存为22±2℃条件下振荡保存5天。由于保存时间短,临床需求量大,目前对血小板的持续供应难以得到保证,战争、自然灾害和突发事件时的保障更加艰难。刘景汉等国内学者们在血小板中加入了冷冻保护剂二甲基亚砜(DMSO)来延长血小板浓缩液的保存时间,目前大约可延长至1年。但DMSO具有一定毒性,FDA许可的DMSO浓度为0.2%,我们国内目前使用DMSO浓度为5%,远期毒性仍无法估测,国家标准操作规程上没有明确对其进行描述。并且-80℃深低温冰冻保存在战争或突发事件时也很难实现。在20世纪50年代,美军通过在添加各种保护剂进行预处理,来提高血小板的抗冻和抗干燥能力以实现对浓缩血小板的冻干保存,提出了冻干血小板(freeze dried platelets,FDP)的概念。FDP有常温保存、体积小、质量轻、便于长途运输等优点。创面是指正常皮肤组织在外界致伤因子如外科手术、外力、热、电流、化学物质、低温以及机体内在因素如局部血液供应障碍等作用下所导致的损害。创面的愈合是一个复杂的生物学过程,其过程包括了炎症反应、细胞增殖、结缔组织形成、创面收缩和创面重塑等几个阶段。在整个过程中多种修复细胞、炎症介质、生长因子和细胞外基质的成份共同参与,并在机体的调控下呈现高度的有序性、完整性和网络性。其中任何一个环节发生紊乱将直接影响创面愈合的进程。20世纪90年代开始,研究者发现血小板能释放多种生物活性物质,其中包括多种生长因子,继而开始研究血小板对创面愈合的作用。目前已经发现血小板能释放300多种生物活性物质。这些生长因子可以促进细胞的增殖与分化,增加胶原的合成能力,对促进基质合成、沉降及组织的形成都有着重要的作用,而且各种生长因子之间有良好的协同作用,可明显促进创面愈合。由于最初研究的外科医生将其称为富血小板血浆(platelet rich plasma, PRP),相关研究对其说法沿用至今。PRP已经广泛应用于创伤修复方面的研究,涉及如口腔颌面外科、眼科、整形、骨科、烧伤等多学科,甚至在基因工程、细胞培养组织工程、抗衰老方面也显现出了独特的作用,治疗效果获得国内外学者的证实和充分肯定,PRP不但可以提高止血效果、缩短手术时间,还可以减轻手术后肿胀、促进伤口愈合,对创伤修复和组织重建具有重要的价值。研究证明FDP在复水化后,恢复率可达60-70%,保留了许多新鲜血小板形态学和功能上的特性。冻干血小板是否能像新鲜血小板一样用于对血液病患者的救治作用仍未知。研究发现复水化后的FDP在被激活后和PRP相似,均可释放出多种生长因子。那么FDP是否能首先应用于创面愈合,我们因此提出我们的研究方案。临床上常见的急性创面除手术切口、皮肤擦伤外,烫伤也是常见病多发病。临床上采用抗生素和手术治疗,虽有一定的疗治疗效果,但患者常常出现创面收敛慢、产生耐药菌、肝肾功能损伤以及机体免疫功能降低等反应：因此本课题希望通过建立SD大鼠深Ⅱ度烫伤模型,来探究FDP在烫伤创面愈合中的修复作用。目的将血小板浓缩液进行冻干处理后制备成FDP,并将其应用于大鼠深Ⅱ度烫伤创面的愈合,观察FDP使用后创面的愈合情况,以验证FDP外用治疗烫伤的疗效,为其进一步应用于临床提供实验依据。方法1、FDP的制备(1)PRP的制备采用无偿献血者捐献的全血,按国家标准检验合格后进行血小板分离,1500×g离心10min分离出上层富含血小板血浆,再将此富含血小板血浆经3000×g离心20min,分离出上层贫血小板血浆和下层富血小板血浆,用贫血小板血浆来调整后者血小板的浓度,直至计数为1000×109/L备用。(2)PRP的冻干处理预处理液的配制：采用NaCl、KCl、CaCl2 MgSO4、NaHCO3、柠檬酸、柠檬酸钠、乙酸钠、葡萄糖、超纯水、海藻糖及可逆性血小板激活抑制剂,调PH为6.6-6.8,0.22μm滤器过滤；冻干缓冲液的配制：血小板预处理液中加入总体积30%的同型血浆,调PH为6.6-6.8,0.22μtm滤器过滤后备用。血小板1500×g离心15min,弃去上清,保留下层血小板沉淀物,用与弃去上清相同体积的预处理液重悬血小板,37℃水浴振荡4h,使血小板保持悬浮状态。4h水浴后,将血小板悬液再以1500×g离心15min,弃去上清,保留下层血小板沉淀物,用与弃去上清相同体积的冻干缓冲液重悬血小板。将预处理后血小板悬液转移到硅化玻璃瓶中,每瓶4m1,置于-80℃超低温冰箱中冷冻过夜,次日将冻干机打开并使温度降至-45℃后,再将样品从-80℃超低温冰箱取出,转入冻干机进行真空干燥,冷阱温度为-45±5℃,真空度<133mbar,24h后取出,并将其密封后保存于室温。(3)冻干血小板复水化检测室温下保存1d以上的样品将其复水化,复水化液为贫血小板血浆(platelet-poor plasma, PPP):无菌水=3：1(v/v),加入4ml复水化液后的样品,轻轻振荡至完全溶解,用血细胞计数仪分别测定冻干前及复水化后血小板计数和平均血小板体积(nean platelet volume, MPV),并计算血小板回收率与MPV冻干前后差值；检测血小板冻干前及冻干后d0、d10、d30生长因子VEGF、TGF-β、PDGF-BB的释放含量。2、SD大鼠深Ⅱ度烫伤模型的建立及FDP用于创面治疗的效果研究将40只大鼠背部脱毛,脱毛面积4cm×6cm左右,用清水洗净,观察24h,确定脱毛部位皮肤无红肿、炎症和破损等异常情况。次日,SD大鼠禁食8h以上,用10%水合氯醛腹腔注射进行麻醉,剂量为300mg/kg,麻醉生效后将大鼠固定于操作台,75%酒精消毒备皮区域。将不锈钢锅盛水置于电磁炉上,并将50g的砝码置于锅内加热至沸腾,持续5mmin。用止血钳夹住砝码上端立即置于大鼠脊柱两侧备皮区,稍加压力,维持15s,即可形成半径为1cm的圆形深Ⅱ度烫伤创面；根据临床烧伤处理常规,3h后行削痂术,直至创面由苍白变为红润为止。将造模成功的40只大鼠随机分成四组,再根据组别进行上药。FDP组：将每瓶冻干血小板用4mL同型血浆复溶,与葡萄糖酸钙以10：1的比例混合进行激活后,喷洒于无菌纱布上,制备成血小板凝胶纱布(1mL/创面),无菌纱布包扎；PRP组：调整血小板浓度为1000×109/L,,其他操作步骤同FDP组；烫伤膏组：无菌棉签直接涂抹后,无菌纱布包扎；空白组：仅用无菌纱布浸湿生理盐水包扎。换药时间分别为d1、d3、d5、d7、d9、d13、d19,换药同时用透明坐标纸覆盖创面,沿创缘画膜,计算创面面积,并每组随机选取一个创面,取直径约为1cm的创面组织用于组织学检查(HE染色)。结果在血小板冻干效果评价中,冻干前后血小板数量和MPV存在着统计学的差异,细胞回收率为87.24%；生长因子VEGF、TGF-β和PDGF-BB释放量随着保存时间的延长并未有统计学上的差异,但PDGF-BB的含量在冻干前后有所差异(P<0.05)。在动物实验中,不同处理组对大鼠烫伤创面愈合率的影响结果表明,在治疗过程中,烫伤创面结痂面积逐步减小,愈合率显著上升。在治疗的d7,PRP组与FDP组均使大鼠烫伤创面面积明显缩小,具有明显的促进创面愈合作用,与实验对照组差异有显著性(P<0.05),而PRP组FDP组之间无明显差异。提示FDP具有与PRP相近的促进烫伤创面早期愈合的作用。不同处理组对大鼠烫伤创面病理组织学的影响。100倍镜下观察d1的组织标本：皮肤损伤至真皮深层,细胞水肿,变性坏死,正常结构消失,呈空洞状,胶原纤维断裂,已符合深Ⅱ度烫伤的判定标准,提示造模成功；用药d7:FDP组和PRP组表皮及真皮组织均有明显的改善,皮肤创面的坏死组织及炎性渗出物显著减少,毛细血管周围有许多新生的成纤维细胞,可见大量肉芽组织形成,而烫伤膏组和空白组仍表现为表皮急性化脓性炎症,细胞变性坏死,仅有少量肉芽组织形成；用药d19:FDP组和PRP组表皮恢复,可见少量毛囊和皮脂腺,细胞形态恢复良好,真皮组织中的胶原纤维排列清晰,无溶解或杂乱现象,烫伤膏组和空白组仍有部分凝固性坏死和少量肉芽组织,未见毛囊和皮脂腺。结论血小板经过冻干后,从血小板的外观、回收率、MPV和冻干前后生长因子含量及稳定性等方面分析,本冻干方案基本可行,已满足冻干和应用要求,并且通过创面愈合率和组织病理学检查证实,FDP还具有与PRP相近的促进烫伤创面愈合的作用。因此,本实验为临床治疗烫伤提供了一种可靠有效的救治方法,验证了FDP外用治疗烫伤的功效,为FDP进一步应用于临床提供了实验依据。属性不符