香蕉是典型的呼吸跃变型成熟热带水果。大量研究结果证实，乙烯是跃变型成熟果实的催熟激素。跃变型成熟果实中自我催化的乙烯合成反应启始后，合成大量乙烯。乙烯被乙烯受体感知并转换成乙烯信号，乙烯信号沿其信号传导途径传递到目标功能基因后，便引发一系列与成熟相关的生理生化反应而促使果实成熟。据此，目前利用生物工程技术延缓跃变型果实成熟的策略主要有以下三种：(1)抑制果实内乙烯的生物合成；(2)降低果实对乙烯的敏感性；(3)切断乙烯信号向受控目标功能基因传递的传导途径。 生物学家已在番茄中克隆了ACC合成酶和ACC氧化酶cDNA，并证实了它们的生(?)学功能，在此基础上，利用反义RNA技术抑制ACC合成酶基因的表达，使乙烯合成大幅度减少，成功地创造出工程延熟番茄品种。 乙烯受体基因首先在拟南芥中被克隆并证实了其功能。在此基础上，从番茄中获得了五个类似拟南芥乙烯受体基因序列的cDNA克隆。其中的NR基因的生物学功能，通过反义RNA技术首先得到证实，这是果实中证实功能的首个乙烯受体基因。NR受体基因发生突变，产生对乙烯不敏感的突变体，其果实不能自然成熟。 在香蕉乙烯表达调控研究方面，本实验室已从香蕉中克隆到一个与番茄ACC合成酶基因序列同源的cDNA，目前正在利用反义RNA技术研究其生物学功能。有报道，在香蕉中已克隆到一个具有序列同源性的乙烯受体cDNA，但未见有进一步证实其功能的研究报道。 1998年Andrew Fire等首先揭示的RNA干扰(RNA interfering,RNAi)现象是一种广泛存在于生物中的、转录后水平调控基因表达的机制。研究表明，RNAi具有特异地使 2 香蕉乙烯受体cDNA克隆与特异性表达及RNAi技术应用于鉴定植物基因功能的方法研究目标基因表达沉默的特性，因此，RNAi在短短的几年中迅速发展成为一种研究基因功能的重要工具，成为生物领域研究的热点。 鉴定己克隆的植物CDNA的生物生物学功能，是其应用于生物工程的前提和基础。目前，香蕉中尚未建立起完善的遗传转化再生受体系统，利用转反义基因技术鉴定基因功能的难度较大。本文在前人的研究基础上，根据已发表的相关序列，克隆了香蕉乙烯受体CDNA序列，并对其分布、表达进行研究，同时采用RNAi技术对报道的香蕉ACC合成酶dNA序列和克隆的乙烯受体cDNA序列进行功能鉴定，以探索建立RNAi技术用于植物功能基因鉴定的方法，同时为调控香蕉果实成熟的基因工程提供依据。研究的主要结果如下： 1．设计引物，用从香蕉果实中提取的总RNA为模板，采用RT－PCR方法扩增得到两条特异CDNA片段。测序结果表明，其中一个较长的CDNA序列与报道的乙烯受体CDNA序列（gb：afll3748）的对应区段长度一致，同源率为99％。另一较短cDNA序列与该Genebank序列的同源率为97％，但缺少该Genebank序列中的第193－1036 hp的区段。分析发现该缺失区段的两端序列具有类似转座子序列中的短正向重复序列特征，但BLAST序列比较结果显示该区段与报道的转座子序列没有序列同源性。 2．利用较长的克隆。DNA中约1．Ikb的区段作探针，与从四个不同香蕉品种类型提取的基因组DNA（经EcoRI限制性内切酶酶切）进行Southern杂交，杂交结果显示，该CDNA序列探针与四种DNA杂交后均出现一条杂交信号带：用从香蕉不同后熟发育阶段果实（果肉）和从根、叶片（来自同一采果母株）中分别提取的总RNA作模板，使用上述克隆乙烯受体基因。DNA序列时所设计的引物进行RT－PCR。扩增结果表明，该CDNA在香蕉果实后熟的几个发育阶段中均有表达，而在根和叶片等组织中检测不到该。DNA的表达。 3．构建了两种形式的dSRNA用于RNAi研究：l）siRNA用于鉴定ACC合成酶CDNA功能，2）ShRNA用于鉴定克隆的乙烯受体CDNA的功能。通过分析报道的香蕉ACC合成酶的CDNA序列，选择位于AUG启始密码子后约100hp处的一段高度保守的Zlbp序列，用化学法合成相应的双链 SIRNA（Stusll iflt6Yf6Y6nC6 RNA），其 3’悬挂突出两个 U核昔 翁酸残基的单链；设计两对引物，PCR扩增克隆的乙烯受体CDNA自sllg启始密码子起的538 hP长区段的正向（记为 SSI）、反向（记为M）DNA序列。正反向片段连接，经测序证实确实连接正确后，插人（替代）植物表达载体PCAMBAI2301中的GUS基因位置并 华南热带农业大学博十论文3经双酶切证实。在所得植物表达载体PCAMBAI2301－SSI－A中，该插入mA片段处丁355启动于之后，在宿主细胞中经转录后得到的mRNA因两端序列反向互补而形成发荚状RNA。同时，文中针对构建含止、反向重复序列插入片段的植物表达载体过程中出现的插入片段链内退火现象造成连接困难进行了分析，并提出解决问题的建议。 4．用基因枪法和直接注射法把该siRNA导入香蕉果实，，同时用基因枪法把上述构建的PCAMBAI230lSSIAI导人香蕉果实，并设立以比0替代SIRNA的对照。转化果实的乙烯释放率和呼吸强度测定结果显示，PCAM13A1230lSSIAI转化果实的呼吸强度的变化趋势与对照的类似；双链SIRNA转化果实与对照相比，