论文部分内容阅读
目的:脓毒症是由于宿主对感染的异常反应而导致的危及生命的器官功能障碍。心肌功能障碍是脓毒症常见的并发症,脓毒症引起的心肌固有收缩和（或）舒张功能异常。超过40%的脓毒症患者存在心功能障碍,合并心功能障碍者病死率会升高至70%～90%,可作为脓毒性休克患者病死率的独立危险因素。临床急需找到保护心肌积极有效的办法。内皮抑素（endostatin,ES）是一种强效的血管内皮细胞生长因子拮抗剂,许多动物实验发现内皮抑素对于许多急性及慢性炎性疾病有治疗作用,并可以降低脓毒症动物血清中TNF-α、IL-1β、IL-6的水平。因此,我们推测,当脓毒症发生后,重组人内皮抑素可以通过减少凋亡从而达到保护心肌细胞功能的作用。1-磷酸鞘氨醇（sphingosine-1-phosphate,S1P）是一种脂质第二信使,参与心脏的多种病理生理反应,是治疗心脏衰竭、心肌缺血再灌注损伤的潜在靶点。本研究旨在研究脂多糖诱导幼年大鼠脓毒症模型后,重组人内皮抑素与心肌细胞凋亡的关系,以及内皮抑素是否通过S1P信号通路影响心肌细胞的凋亡。研究方法:第一部分:（1）选取112只健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠（日龄21天）随机分为对照组、模型组和内皮抑素组,模型组分为2h、4h、6h、12h、24h、48h、72h7个时间点,内皮抑素组分为6h及12h2个时间点,每个时间点又分为4组。以上每组均含8只大鼠。采用腹腔注射脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS,5mg/kg,10ml/kg）建立脓毒症模型,30min后注射重组人内皮抑素（4μg/kg,10ml/kg）,随后在不同时间点（2h、4h、6h、12h、24h、48h、72h）通过Luminex、酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay ELISA）及生化分析仪检测血清内皮抑素、细胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）及心肌酶谱来观察内皮抑素在脓毒症大鼠的表达变化及重组人内皮抑素是否对心脏有保护作用,通过HE染色观察心肌组织变化,TUNEL染色观察心肌组织凋亡情况,并通过RT-PCR、western blot方法检测心肌组织中凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax及cleaved-Caspase3的表达。（2）大鼠心肌细胞株（H9C2细胞）随机分为H9C2组、H9C2+ES组、H9C2+LPS组、H9C2+LPS+ES组,每组设3个复孔。H9C2+ES组加入内皮抑素（4μg/m L）;H9C2+LPS组加入LPS（10μg/m L）;H9C2+LPS+ES组先加入LPS（10μg/m L）,培养箱中培养0.5h后加入重组人内皮抑素（4μg/m L）。通过TUNEL-免疫荧光（immunoinfluorescent staining,IF）双染、流式细胞技术来计数各组细胞凋亡比例,通过RT-PCR、Western blot方法检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax及cleaved-Caspase3的表达。第二部分:分组同第一部分,通过RT-PCR、western blot及免疫荧光的方法,明确在脓毒症急性期,重组人内皮抑素是否在大体心肌组织及H9C2细胞系影响S1P及其受体（S1PR1、S1PR2及S1PR3）的表达,确定内皮抑素主要作用于S1PR2。第三部分:（1）动物分组:将48只健康雄性21日龄SD大鼠随机分为四组:对照组、NC组、模型组和内皮抑素组。模型组及内皮抑素组进一步随机分为2组:6h组及12h组。每个时间段每组8只鼠。NC组大鼠腹腔注射S1PR2蛋白拮抗剂JTE-013（10mg/kg,10ml/kg）,模型组及内皮抑素组大鼠给与JTE-013作用半小时后,腹腔注射LPS（5mg/kg,10ml/kg）,再次作用半小时后,内皮抑素组大鼠腹腔注射重组人内皮抑素（5mg/kg,10ml/kg）。（2）细胞分组:将S1PR2-shRNA转染H9C2细胞,建立稳转株,并将细胞随机分为4组:NC组、shRNA组、LPS组及LPS+内皮抑素组。NC组及shRNA组为正常培养基;LPS组为S1PR2-shRNA稳转株加入LPS（10μg/m L）;LPS+内皮抑素组为S1PR2-shRNA稳转株先加入LPS（10μg/m L）,培养箱中培养30min后加入内皮抑素（4μg/m L）。通过TUNEL、RT-PCR、western blot、流式细胞计数检测大体抑制S1PR2及H9C2细胞沉默S1PR2后心肌细胞凋亡的情况。（3）细胞增殖情况采用CCK-8方法检测。（4）流式细胞方法检测细胞周期。结果:第一部分:（1）在脓毒症急性期（4h）,内源性内皮抑素在血清及心肌组织中的表达即明显降低（P<0.01）,虽然随时间延长,内皮抑素表达有上升趋势,但直至72h仍明显低于对照组（P<0.01）;（2）在脓毒症各时间点,细胞因子水平均明显高于对照组（P<0.05）,其中6h及12h细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6血清浓度达到高峰（P<0.01）,本研究选取6h及12h为主要研究时间点。与模型组相比,内皮抑素可以显著减低大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6的水平（P<0.01）,确定其适宜给药浓度为4μg/kg。重组人内皮抑素还能显著降低血清CK、CKMB及LDH水平（P<0.01）。（3）在动物实验中,与对照组相比,模型组Bcl-2蛋白表达显著降低,其mRNA表达亦显著降低（P<0.01）,Bax蛋白及mRNA表达均显著上升（P<0.01）,cleaved-Caspase3蛋白表达量亦上升（P<0.05）;与模型组相比,内皮抑素组Bcl-2蛋白及mRNA表达均有回升（P<0.01）,Bax蛋白及mRNA表达量及cleaved-Caspase3蛋白表达量均有回落（P<0.01）;TUNEL结果显示,模型组较对照组凋亡细胞比例明显升高（P<0.01）,内皮抑素组较模型组凋亡细胞比例明显下降（P<0.01）。（4）在细胞实验中,与H9C2组相比,H9C2+ES组凋亡相关蛋白表达无明显差异,而H9C2+LPS组Bcl-2蛋白及mRNA表达量明显下降（P<0.01）,Bax蛋白及mRNA表达明显上升（P<0.01）,cleaved-Caspase3蛋白表达量亦上升（P<0.05）;与H9C2+LPS组相比,H9C2+LPS+ES组Bcl-2蛋白及mRNA表达量回升（P<0.01）,Bax蛋白及mRNA表达显著下降（P<0.01）,而cleaved-Caspase3蛋白表达量下降（P<0.05）。细胞TUNEL-IF及流式细胞检测凋亡细胞结果显示,与H9C2组相比,H9C2+ES组凋亡细胞比例无明显差异,H9C2+LPS组细胞凋亡明显增多（P<0.01）,与H9C2+LPS组相比,H9C2+LPS+ES组凋亡细胞明显下降（P<0.01）。第二部分:（1）动物实验中,模型组与对照组S1P蛋白及mRNA表达均有下降（P<0.01）,内皮抑素组与模型组相比,S1P蛋白及mRNA表达均上升（P<0.01,12hRT-PCR P<0.05）。与对照组相比,12h模型组S1PR1蛋白表达无明显变化,mRNA表达下降（P<0.05）,其余模型组S1PR1、S1PR2及S1PR3蛋白及mRNA表达均下降（P<0.01）。与模型组相比,内皮抑素组S1PR1在6h蛋白及mRNA表达无差异,12h蛋白表达下降（P<0.05）而mRNA表达无差异;内皮抑素组S1PR2蛋白及mRNA表达均显著上升（P<0.01）;S1PR3在6h蛋白表达无变化,mRNA表达下降（P<0.01）,在12h蛋白表达（P<0.01）及mRNA表达（P<0.05）均下降。免疫荧光结果显示,模型组S1PR2表达量明显下降（P<0.01）。（2）细胞实验中,与H9C2组相比,H9C2+ES组S1P蛋白及mRNA表达无明显差异,H9C2+LPS组S1P蛋白及mRNA水平明显降低（P<0.01）,而与H9C2+LPS组相比,H9C2+LPS+ES组S1P蛋白表达上升（P<0.05）,mRNA表达亦上升（P<0.01）。第三部分:（1）动物实验中,对照组与NC组各指标无明显差异,给与S1PR2拮抗剂JTE-013后,虽然模型组中Bcl-2下降（P<0.01）及Bax上升（P<0.01）趋势没有改变,但与模型组相比,内皮抑素组Bcl-2与Bax蛋白及mRNA表达无明显差异,cleaved-Caspase3蛋白表达也没有差异。TUNEL结果显示模型组凋亡细胞较对照组增多（P<0.01）,内皮抑素组与模型组之间无差异。（2）细胞实验结果显示NC组与shRNA组凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax及cleaved-Caspase3蛋白及mRNA表达无差异,shRNA+LPS组Bcl-2蛋白及mRNA表达下降（P<0.01）,Bax蛋白及mRNA表达无差异,cleaved-Caspase3蛋白表达上升（P<0.01）。TUNEL及流式细胞分析示与shRNA+LPS组相比,shRNA+LPS+ES组细胞凋亡比例上升（P<0.01）。（3）CCK-8对各组细胞增殖检测,H9C2组与H9C2+ES组细胞增殖无差异,H9C2+LPS组细胞增殖明显下降（P<0.01）,而H9C2+LPS+ES组细胞增殖回升（P<0.01）;阻断S1PR2后,与LPS组相比,LPS+ES组细胞增殖无差异。（4）流式细胞仪检测细胞周期结果:与H9C2组相比,H9C2+ES组细胞各期比例无差异,H9C2+LPS组细胞G1期比例下降（P<0.01）,G2期细胞比例上升（P<0.01）;与H9C2+LPS组相比,H9C2+LPS+ES组细胞G1期比例上升（P<0.01）,G2期细胞比例下降（P<0.01）;阻断S1PR2后,与LPS组相比,LPS+内皮抑素组各细胞周期比例分布无差异。结论:1、脓毒症早期（4小时）血清中内皮抑素即下降;2、重组人内皮抑素可通过下调血清中细胞因子的表达、减少心肌细胞凋亡、增加细胞增殖、调节细胞周期从而保护心肌组织;3、内皮抑素可上调脓毒症模型中S1P/S1PR2的表达,可能为内皮抑素调节心肌细胞凋亡的潜在靶点;4、为内皮抑素应用于临床治疗脓毒症提供理论依据。