论文部分内容阅读
目的：1.以PIK3CA/ΔNp63α复合物作为肿瘤激活抑制域，利用生物信息学和相关体外实验，分析PIK3CA在乳腺癌中的热点突变及突变后乳腺癌下游通路激活的内在分子机制。2.研究天然小分子化合物百里醌（Thymoquinone,TQ）已知的抑制乳腺癌PI3K/Akt1通路作用。3.探索TQ是否能够抑制乳腺癌PI3K/Akt1/MDM2通路中PIK3CA两个热点突变的激活。
方法：1.通过NCBI程序分析PIK3CA基因和氨基酸序列在不同物种中是否存在保守；利用Kaplan-Meier绘图仪进行了无复发生存率（Recurrence Free Survival,RFS）分析，以便了解PIK3CA的高表达与乳腺癌RFS的相关关系；同时从“Cancer Browser”肿瘤大数据网站中进一步分析PIK3CA在乳腺癌患者中的突变数据以确定是否有热点突变。2.PIK3CA基因及其突变体的表达载体克隆：先从Addgene官网获得了三种以穿刺菌为载体的质粒pHAGE-PIK3CA-WT、pHAGE-p.H1047L和pHAGE-p.H1047R，设计引物后将我们的目的片段用PCR仪扩增出来以进行下一步分子克隆，接着将三段目的片段分别载入pcDNA?5/FRT/TO/2ⅹFLAG载体中，克隆成功后进行菌落PCR扩增、双酶切鉴定以及测序验证克隆是否成功。3.将克隆成功的重组质粒首先在BT-549、HeLa细胞系中进行脂质体转染，利用蛋白质免疫印迹技术（Western Blot,WB）验证重组质粒能否成功表达FLAG标签蛋白，同时进行p-Akt和Akt表达强弱的检测。4.利用生物信息学相关软件分析了在PIK3CA/ΔNp63α复合物中PIK3CA的2个热点突变：p.H1047R、p.H1047L，与PIK3CA-野生型（Wild Type,WT）对比前面二者突变后分子内部发生的变化以探索乳腺癌患者PI3K/Akt1/MDM2通路的激活机制；这些方法包括同源建模、结构和功能预测、蛋白质相互作用分析（Protein-Protein Interaction Analysis,PPI）、分子动力学（Molecular Dynamics,MD）模拟和轨迹分析。5.分别在BT-549、HeLa细胞系中加入三种重组质粒pcDNA?5-PIK3CA-WT、pcDNA?5-p.H1047L和pcDNA?5-p.H1047R，转染一定时间后用10μM TQ处理，处理细胞时用适量EBC buffer裂解后利用WB进行下游信号通路的检测。6.TQ处理后突变组较WT组下游信号通路有明显变化后，针对TQ与PIK3CA进行了分子对接研究（Molecular Docking,MD）。
结果：1.PIK3CA在不同物种中高度保守，其高表达与乳腺癌低RFS相关，证明其在乳腺癌患者中起致癌作用。乳腺癌患者所有突变基因中PIK3CA突变频率最高（28.9%），而在PIK3CA突变中其H1047位的突变发生率最高，位居前列的分别是p.H1047R和p.H1047L。2.构建的三种重组质粒分别通过了PCR、双酶切、测序验证，且均能够在细胞中成功表达FLAG标签蛋白，证明克隆成功。重组质粒在BT-549细胞和HeLa细胞中转染后，WB发现突变能够增强Akt1磷酸化（BT-549细胞中p.H1047R的磷酸化程度比p.H1047L略高），但不增加Akt1的总量。3.PIK3CA/ΔNp63α复合物的晶体结构带状图提示p-Akt1水平的升高可能是由于p.H1047R和p.H1047L突变改变了PIK3CA/ΔNp63α复合物的构象所致，PPI相关数据可以说明p.H1047R比p.H1047L能更有效地破坏PIK3CA/ΔNp63α复合物稳定性。4.突变后PIK3CA/ΔNp63α复合物内氨基酸数量和氢键数量、强弱的变化会影响PIK3CA与ΔNp63α的相互作用。而MD模拟分析发现在20、30、40和50ns时间轴上p.H1047R突变体的构象变化最为严重，不仅如此，轨迹分析也进一步发现突变后，尤其是p.H1047R突变体波动性增加最为明显。主成分分析（Principal Component Analysis,PCA）、构象熵和自由能形貌图（Free Energy Landscapes,FEL）进一步解释了PI3K通路中Akt1磷酸化的增加。5.TQ处理过表达重组质粒后可以有效抑制突变体（p.H1047R、p.H1047L）中PI3K/Akt1通路下游蛋白：p-Akt、MDM2，以及磷脂酰肌醇3,4,5三磷酸（phosphatidylinositol3,4,5triphosphate,PIP3）的表达或者活性。TQ与PIK3CA的分子对接研究结果表明，TQ可以与PIK3CA结合，结合位点在PIK3CA第700-1000氨基酸残基周围区域，推测TQ可以通过结合在PIK3CA激酶结构域发挥其抑制作用。
结论：在功能上，我们的研究结果清楚地证实了两种突变体p.H1047R和p.H1047L可以降低ΔNp63α对PIK3CA激酶结构域的抑制作用，导致通过WB检测观察到的PI3K下游信号的活性增加。在结构上，ΔNp63α的DNA结合域（残基：114-359）和PIK3CA的激酶域（残基：797-1068）之间的相互作用在突变后构象被部分破坏。两个热点突变体p.H1047R和p.H1047L经TQ处理后可以观察到下游通路明显被抑制，TQ与PIK3CA的对接结果表明TQ可能通过抑制PIK3CA的激酶结构域发挥其重要作用。PIK3CA两个热点突变的研究不仅有助于转移性乳腺癌（metastatic breast cancer,MBC）患者疾病机制探索，而且对于研究者开发新的小分子靶向治疗策略有重要意义。
方法：1.通过NCBI程序分析PIK3CA基因和氨基酸序列在不同物种中是否存在保守；利用Kaplan-Meier绘图仪进行了无复发生存率（Recurrence Free Survival,RFS）分析，以便了解PIK3CA的高表达与乳腺癌RFS的相关关系；同时从“Cancer Browser”肿瘤大数据网站中进一步分析PIK3CA在乳腺癌患者中的突变数据以确定是否有热点突变。2.PIK3CA基因及其突变体的表达载体克隆：先从Addgene官网获得了三种以穿刺菌为载体的质粒pHAGE-PIK3CA-WT、pHAGE-p.H1047L和pHAGE-p.H1047R，设计引物后将我们的目的片段用PCR仪扩增出来以进行下一步分子克隆，接着将三段目的片段分别载入pcDNA?5/FRT/TO/2ⅹFLAG载体中，克隆成功后进行菌落PCR扩增、双酶切鉴定以及测序验证克隆是否成功。3.将克隆成功的重组质粒首先在BT-549、HeLa细胞系中进行脂质体转染，利用蛋白质免疫印迹技术（Western Blot,WB）验证重组质粒能否成功表达FLAG标签蛋白，同时进行p-Akt和Akt表达强弱的检测。4.利用生物信息学相关软件分析了在PIK3CA/ΔNp63α复合物中PIK3CA的2个热点突变：p.H1047R、p.H1047L，与PIK3CA-野生型（Wild Type,WT）对比前面二者突变后分子内部发生的变化以探索乳腺癌患者PI3K/Akt1/MDM2通路的激活机制；这些方法包括同源建模、结构和功能预测、蛋白质相互作用分析（Protein-Protein Interaction Analysis,PPI）、分子动力学（Molecular Dynamics,MD）模拟和轨迹分析。5.分别在BT-549、HeLa细胞系中加入三种重组质粒pcDNA?5-PIK3CA-WT、pcDNA?5-p.H1047L和pcDNA?5-p.H1047R，转染一定时间后用10μM TQ处理，处理细胞时用适量EBC buffer裂解后利用WB进行下游信号通路的检测。6.TQ处理后突变组较WT组下游信号通路有明显变化后，针对TQ与PIK3CA进行了分子对接研究（Molecular Docking,MD）。
结果：1.PIK3CA在不同物种中高度保守，其高表达与乳腺癌低RFS相关，证明其在乳腺癌患者中起致癌作用。乳腺癌患者所有突变基因中PIK3CA突变频率最高（28.9%），而在PIK3CA突变中其H1047位的突变发生率最高，位居前列的分别是p.H1047R和p.H1047L。2.构建的三种重组质粒分别通过了PCR、双酶切、测序验证，且均能够在细胞中成功表达FLAG标签蛋白，证明克隆成功。重组质粒在BT-549细胞和HeLa细胞中转染后，WB发现突变能够增强Akt1磷酸化（BT-549细胞中p.H1047R的磷酸化程度比p.H1047L略高），但不增加Akt1的总量。3.PIK3CA/ΔNp63α复合物的晶体结构带状图提示p-Akt1水平的升高可能是由于p.H1047R和p.H1047L突变改变了PIK3CA/ΔNp63α复合物的构象所致，PPI相关数据可以说明p.H1047R比p.H1047L能更有效地破坏PIK3CA/ΔNp63α复合物稳定性。4.突变后PIK3CA/ΔNp63α复合物内氨基酸数量和氢键数量、强弱的变化会影响PIK3CA与ΔNp63α的相互作用。而MD模拟分析发现在20、30、40和50ns时间轴上p.H1047R突变体的构象变化最为严重，不仅如此，轨迹分析也进一步发现突变后，尤其是p.H1047R突变体波动性增加最为明显。主成分分析（Principal Component Analysis,PCA）、构象熵和自由能形貌图（Free Energy Landscapes,FEL）进一步解释了PI3K通路中Akt1磷酸化的增加。5.TQ处理过表达重组质粒后可以有效抑制突变体（p.H1047R、p.H1047L）中PI3K/Akt1通路下游蛋白：p-Akt、MDM2，以及磷脂酰肌醇3,4,5三磷酸（phosphatidylinositol3,4,5triphosphate,PIP3）的表达或者活性。TQ与PIK3CA的分子对接研究结果表明，TQ可以与PIK3CA结合，结合位点在PIK3CA第700-1000氨基酸残基周围区域，推测TQ可以通过结合在PIK3CA激酶结构域发挥其抑制作用。
结论：在功能上，我们的研究结果清楚地证实了两种突变体p.H1047R和p.H1047L可以降低ΔNp63α对PIK3CA激酶结构域的抑制作用，导致通过WB检测观察到的PI3K下游信号的活性增加。在结构上，ΔNp63α的DNA结合域（残基：114-359）和PIK3CA的激酶域（残基：797-1068）之间的相互作用在突变后构象被部分破坏。两个热点突变体p.H1047R和p.H1047L经TQ处理后可以观察到下游通路明显被抑制，TQ与PIK3CA的对接结果表明TQ可能通过抑制PIK3CA的激酶结构域发挥其重要作用。PIK3CA两个热点突变的研究不仅有助于转移性乳腺癌（metastatic breast cancer,MBC）患者疾病机制探索，而且对于研究者开发新的小分子靶向治疗策略有重要意义。