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目的
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)是一种螺旋形状,微需氧且具有鞭毛的革兰氏阴性细菌,可粘附于人类的胃粘膜表面,是目前已发现的唯一一种在人类胃部定殖的病原菌,可导致慢性活动性胃炎,消化性溃疡,甚至胃癌。目前全球约一半的人口已经感染幽门螺杆菌。
四联疗法是目前临床上治疗幽门螺杆菌的主要方法,即使用两种抗生素,并同时联用一种胶体铋剂和质子泵抑制剂。其中最常用的抗生素为三大类,分别为:阿莫西林(β-内酰胺类),克拉霉素(大环内酯类)和甲硝唑(硝基咪唑类)。
但是近年来,幽门螺杆菌对多种抗生素的耐药性逐渐升高,出现了临床多耐药菌株,幽门螺杆菌的清除率也逐渐降低。
双组分系统是一种重要的信号转导媒介,由传感器激酶和响应调节因子两部分组成,可感知外界条件的刺激,调节自身基因的表达从而做出应激反应。已有大量研究发现,双组分系统在细菌的多耐药中发挥重要作用。幽门螺杆菌中表达三种双组分系统,分别是CrdRS,FlgRS和ArsRS,目前还没有报道幽门螺杆菌中的双组分系统参与其耐药。本课题通过实时定量PCR检测抗生素处理后的野生株中三种双组分系统基因的表达情况,发现ArsRS的表达降低,而另外两种双组分系统的表达情况没有明显变化,因此我们将通过最小抑菌浓度,细菌克隆形成,H33342荧光累积,突变率检测等一系列实验进一步探索ArsRS是否参与幽门螺杆菌的多耐药及其耐药机制。
方法
1:使用阿莫西林,克拉霉素,甲硝唑分别处理野生株Hp26695,提取mRNA,反转录得到cDNA进行qPCR,检测三种双组分系统的表达情况,筛选出表达有显著差异的双组分系统。
2:根据同源重组原理,构建基因敲除株ΔarsS。
3:检测野生株和ΔarsS菌株对多种抗生素的MIC。
4:测量野生株与ΔarsS菌株的生长曲线。
5:检测野生株与ΔarsS菌株对多种抗生素的细菌克隆形成情况。
6:通过荧光累积实验,检测野生株与ΔarsS菌株的药物外排能力。
7:检测野生株与ΔarsS菌株中多种抗生素耐药基因的碱基突变率和突变率变化倍数。
8:分别用阿莫西林,环丙沙星,甲硝唑处理野生株Hp26695,通过转录组测序技术检测Hp基因组中所有可能参与DNA损伤修复的基因的表达情况,筛选出低表达且参与基因突变的基因mutS和mutY。
9:检测mutS和mutY在临床敏感株和临床多耐药株中的表达情况。
10:构建ArsRD52N点突变株,在ArsRD52N和ΔarsS菌株中分别检测mutS和mutY的表达情况。
11:在野生株Hp26695的基础上,构建基因敲除株ΔmutS和ΔmutY。
12:检测ΔmutS和ΔmutY菌株对多种抗生素的MIC。
13:测量ΔmutS和ΔmutY菌株的生长曲线。
14:检测ΔmutS和ΔmutY菌株对多种抗生素的细菌克隆形成情况。
15:检测ΔmutS和ΔmutY菌株中多种抗生素耐药基因的碱基突变率和突变率变化倍数。
结果
1:双组分系统ArsRS在抗生素处理的Hp26695中表达降低,CrdRS和FlgRS的表达无明显变化。
2:根据同源重组原理,成功构建基因敲除株ΔarsS。
3:对比野生株和ΔarsS菌株对多种抗生素的MIC,发现与野生株相比,ΔarsS菌株对多种抗生素的敏感性均降低。
4:比较野生株与ΔarsS菌株的生长曲线,发现敲除arsS基因后不影响细菌的生长能力。
5:比较野生株与ΔarsS菌株对多种抗生素的细菌克隆形成情况,发现ΔarsS菌株在抗生素平板上形成更多的单克隆,耐药性增强。
6:荧光累积实验中,与野生株相比,ΔarsS菌株对荧光染料H33342的累积明显升高,其药物外排能力未增强。
7:对比野生株与ΔarsS菌株的碱基突变率及突变率变化倍数,发现与野生株相比,ΔarsS菌株对多种抗生素的突变频率升高,耐药基因的突变位点也增多。
8:转录组测序结果发现5种DNA损伤修复基因低表达,根据已有文献报道,仅mutS和mutY参与细菌的基因突变。
9:mutS和mutY在临床敏感株和临床多耐药株中均低表达。
10:成功构建点突变株ArsRD52N,ArsRD52和ΔarsS菌株中mutS和mutY均低表达。
11:在野生株Hp26695的基础上,成功构建基因敲除株ΔmutS和ΔmutY。
12:与野生株相比,ΔmutS和ΔmutY菌株对阿莫西林,甲硝唑,环丙沙星的敏感性降低,对克拉霉素和四环素耐药性无差异。
13:测量野生株,ΔmutS和ΔmutY菌株的生长曲线发现,敲除mutS和mutY后不影响菌株的生长能力。
14:对比野生株与ΔmutS,ΔmutY菌株对多种抗生素的细菌克隆形成情况,发现ΔmutS和ΔmutY菌株在含有阿莫西林,甲硝唑,环丙沙星的平板上形成更多的单克隆,耐药性增强。
15:对比野生株与ΔmutS和ΔmutY菌株的碱基突变率及突变率变化倍数,发现与野生株相比,ΔmutS和ΔmutY菌株对阿莫西林,甲硝唑,环丙沙星的突变频率升高,耐药基因的突变位点也增多。
结论
ArsRS双组分系统在幽门螺杆菌的多耐药中发挥重要作用,通过降低DNA损伤修复基因mutS和mutY的表达,减弱了细菌修复突变的能力,基因突变增加,从而增强了幽门螺杆菌对多种抗生素的耐受性,适应压力环境。
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)是一种螺旋形状,微需氧且具有鞭毛的革兰氏阴性细菌,可粘附于人类的胃粘膜表面,是目前已发现的唯一一种在人类胃部定殖的病原菌,可导致慢性活动性胃炎,消化性溃疡,甚至胃癌。目前全球约一半的人口已经感染幽门螺杆菌。
四联疗法是目前临床上治疗幽门螺杆菌的主要方法,即使用两种抗生素,并同时联用一种胶体铋剂和质子泵抑制剂。其中最常用的抗生素为三大类,分别为:阿莫西林(β-内酰胺类),克拉霉素(大环内酯类)和甲硝唑(硝基咪唑类)。
但是近年来,幽门螺杆菌对多种抗生素的耐药性逐渐升高,出现了临床多耐药菌株,幽门螺杆菌的清除率也逐渐降低。
双组分系统是一种重要的信号转导媒介,由传感器激酶和响应调节因子两部分组成,可感知外界条件的刺激,调节自身基因的表达从而做出应激反应。已有大量研究发现,双组分系统在细菌的多耐药中发挥重要作用。幽门螺杆菌中表达三种双组分系统,分别是CrdRS,FlgRS和ArsRS,目前还没有报道幽门螺杆菌中的双组分系统参与其耐药。本课题通过实时定量PCR检测抗生素处理后的野生株中三种双组分系统基因的表达情况,发现ArsRS的表达降低,而另外两种双组分系统的表达情况没有明显变化,因此我们将通过最小抑菌浓度,细菌克隆形成,H33342荧光累积,突变率检测等一系列实验进一步探索ArsRS是否参与幽门螺杆菌的多耐药及其耐药机制。
方法
1:使用阿莫西林,克拉霉素,甲硝唑分别处理野生株Hp26695,提取mRNA,反转录得到cDNA进行qPCR,检测三种双组分系统的表达情况,筛选出表达有显著差异的双组分系统。
2:根据同源重组原理,构建基因敲除株ΔarsS。
3:检测野生株和ΔarsS菌株对多种抗生素的MIC。
4:测量野生株与ΔarsS菌株的生长曲线。
5:检测野生株与ΔarsS菌株对多种抗生素的细菌克隆形成情况。
6:通过荧光累积实验,检测野生株与ΔarsS菌株的药物外排能力。
7:检测野生株与ΔarsS菌株中多种抗生素耐药基因的碱基突变率和突变率变化倍数。
8:分别用阿莫西林,环丙沙星,甲硝唑处理野生株Hp26695,通过转录组测序技术检测Hp基因组中所有可能参与DNA损伤修复的基因的表达情况,筛选出低表达且参与基因突变的基因mutS和mutY。
9:检测mutS和mutY在临床敏感株和临床多耐药株中的表达情况。
10:构建ArsRD52N点突变株,在ArsRD52N和ΔarsS菌株中分别检测mutS和mutY的表达情况。
11:在野生株Hp26695的基础上,构建基因敲除株ΔmutS和ΔmutY。
12:检测ΔmutS和ΔmutY菌株对多种抗生素的MIC。
13:测量ΔmutS和ΔmutY菌株的生长曲线。
14:检测ΔmutS和ΔmutY菌株对多种抗生素的细菌克隆形成情况。
15:检测ΔmutS和ΔmutY菌株中多种抗生素耐药基因的碱基突变率和突变率变化倍数。
结果
1:双组分系统ArsRS在抗生素处理的Hp26695中表达降低,CrdRS和FlgRS的表达无明显变化。
2:根据同源重组原理,成功构建基因敲除株ΔarsS。
3:对比野生株和ΔarsS菌株对多种抗生素的MIC,发现与野生株相比,ΔarsS菌株对多种抗生素的敏感性均降低。
4:比较野生株与ΔarsS菌株的生长曲线,发现敲除arsS基因后不影响细菌的生长能力。
5:比较野生株与ΔarsS菌株对多种抗生素的细菌克隆形成情况,发现ΔarsS菌株在抗生素平板上形成更多的单克隆,耐药性增强。
6:荧光累积实验中,与野生株相比,ΔarsS菌株对荧光染料H33342的累积明显升高,其药物外排能力未增强。
7:对比野生株与ΔarsS菌株的碱基突变率及突变率变化倍数,发现与野生株相比,ΔarsS菌株对多种抗生素的突变频率升高,耐药基因的突变位点也增多。
8:转录组测序结果发现5种DNA损伤修复基因低表达,根据已有文献报道,仅mutS和mutY参与细菌的基因突变。
9:mutS和mutY在临床敏感株和临床多耐药株中均低表达。
10:成功构建点突变株ArsRD52N,ArsRD52和ΔarsS菌株中mutS和mutY均低表达。
11:在野生株Hp26695的基础上,成功构建基因敲除株ΔmutS和ΔmutY。
12:与野生株相比,ΔmutS和ΔmutY菌株对阿莫西林,甲硝唑,环丙沙星的敏感性降低,对克拉霉素和四环素耐药性无差异。
13:测量野生株,ΔmutS和ΔmutY菌株的生长曲线发现,敲除mutS和mutY后不影响菌株的生长能力。
14:对比野生株与ΔmutS,ΔmutY菌株对多种抗生素的细菌克隆形成情况,发现ΔmutS和ΔmutY菌株在含有阿莫西林,甲硝唑,环丙沙星的平板上形成更多的单克隆,耐药性增强。
15:对比野生株与ΔmutS和ΔmutY菌株的碱基突变率及突变率变化倍数,发现与野生株相比,ΔmutS和ΔmutY菌株对阿莫西林,甲硝唑,环丙沙星的突变频率升高,耐药基因的突变位点也增多。
结论
ArsRS双组分系统在幽门螺杆菌的多耐药中发挥重要作用,通过降低DNA损伤修复基因mutS和mutY的表达,减弱了细菌修复突变的能力,基因突变增加,从而增强了幽门螺杆菌对多种抗生素的耐受性,适应压力环境。