目的:　　 肿瘤是严重危害人类健康的主要杀手。最近的研究表明，肿瘤细胞信号转导通路的异常是导致肿瘤早期发生和晚期侵袭转移的主要原因。对肿瘤的发病机制及其诊断治疗的研究是我国目前肿瘤研究的一个重要课题。　　 p21激活激酶(p-21 activated kinases，PAKs)是一类进化上高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激，为Rho家族小鸟苷三磷酸酶(Rho-GTPase) Cdc42/Rac1、生长因子信号的下游主要靶蛋白，参与细胞内多个信号转导通路，发挥调节细胞运动、细胞周期演进、基因转录、细胞转化及介导生存与死亡信号等多种效应，并在肿瘤的发生发展过程中起到重要作用。迄今为止PAK家族共发现6个成员，根据其结构相似性，将它们分为两类，Ⅰ类包括PAK1-3，Ⅱ类包括PAK4-6。PAK4作为Ⅱ类PAK的代表性成员，与肿瘤的发生发展密切相关。　　 SCG10是我们通过酵母双杂交实验筛选出的一个PAK4新的互作蛋白。SCG10作为微管不稳定因子，主要参与微管稳态的维持和神经元发育，而在肿瘤发生过程中的功能尚无报道。　　 本研究以蛋白质相互作用为前提，在证实PAK4与SCG10在体内外相互作用的基础上，探讨PAK4与SCG10通路之间的对话，及它们对胃癌细胞侵袭转移的作用，为明确胃癌发生发展的分子机制提供依据。同时，我们通过Kinase Glo激酶发光检测方法对计算机辅助设计的针对PAK4的小分子化合物进行高通量筛选，得到PAK4小分子抑制剂CL14。验证其对PAK4激酶活性的抑制作用，研究该小分子抑制剂对高表达PAK4的肿瘤细胞生物学功能的影响，并深入探讨其作用机制，为研究和开发新型抗肿瘤药物提供依据。　　 方法:　　 一、PAK4激酶介导的SCG10磷酸化参与胃癌细胞转移　　 1、免疫共沉淀实验证实PAK4与SCG10在细胞内的相互作用。　　 2、共焦激光扫描显微镜观察PAK4与SCG10的定位及共定位。　　 3、体外激酶实验分析检测PAK4对SCG10的磷酸化情况。　　 4、免疫荧光和Western blot实验检测PAK4和磷酸化的SCG10对微管稳定性的影响。　　 5、利用Transwell和MTT方法检测磷酸化的SCG10对胃癌细胞迁移、侵袭和生长的作用。　　 6、利用裸鼠荷瘤实验观察分析磷酸化的SCG10对胃癌细胞转移能力的影响。　　 7、利用Western blot、免疫组化和Spearman分析方法证实PAK4和磷酸化的SCG10在胃癌组织样本中存在正相关性。　　 8、Kruskal-Wallis rank和Mann-Whitney检验分析磷酸化的SCG10与胃癌特征的相互关系。　　 二、新型PAK4激酶抑制剂抑制肿瘤细胞侵袭　　 1、Kinase Glo激酶发光检测方法对计算机辅助设计的针对PAK4的小分子化合物进行高通量筛选，获得具有活性的小分子化合物。　　 2、计算机模拟小分子化合物CL14与PAK4蛋白分子的对接情况。　　 3、激酶分析实验检测CL14在体外对PAK家族激酶活性的影响。　　 4、应用生物素-链霉亲和素方法检测CL14与PAK4激酶的作用区域。　　 5、MTT实验检测CL14对PAK4高表达肿瘤细胞增殖的影响。　　 6、流式细胞术检测CL14对PAK4高表达肿瘤细胞细胞周期的影响。　　 7、Transwell实验检测CL14对PAK4高表达肿瘤细胞迁移及侵袭能力的影响。　　 8、Western Blot检测CL14对HGF下游c-Met/PAK4/LIMK1及PAK4/SCG10信号通路的影响。　　 9、Western Blot检测CL14对PAK4/ERK及PAK4/c-Src信号通路的影响。　　 结果:　　 一、PAK4激酶介导的SCG10磷酸化参与胃癌细胞转移　　 1、PAK4与SCG10能够在胃癌细胞SGC-7901内和临床胃癌组织中相互作用。　　 2、PAK4与SCG10能够在胃癌细胞SGC-7901细胞质中共定位。　　 3、PAK4磷酸化SCG10第50位丝氨酸。　　 4、PAK4和磷酸化的SCG10能够促进胃癌细胞的微管不稳定性。　　 5、磷酸化的SCG10能够促进胃癌细胞的迁移和侵袭，并不促进其增殖。　　 6、靶向小分子抑制剂和RNA干扰的方法抑制PAK4活性可以下调SCG10第50位丝氨酸的磷酸化进而阻断胃癌细胞的迁移和侵袭。　　 7、磷酸化的SCG10能够促进胃癌细胞的转移能力。　　 8、PAK4和磷酸化的SCG10在胃癌组织中的表达呈正相关。　　 9、磷酸化的SCG10与胃癌的TNM分期密切相关。　　 二、新型PAK4激酶抑制剂抑制肿瘤细胞侵袭　　 1、通过Kinase Glo激酶发光方法筛选得到CL14等多个能够影响PAK4激酶活性的小分子化合物，从中选择对PAK4抑制作用比较明显的CL14作为研究对象。　　 2、CL14以剂量依赖的方式抑制PAK4的激酶活性，且在PAK家族中具有特异性。　　 3、CL14能够和PAK4的碳末端结合。　　 4、CL14能够抑制PAK4高表达肿瘤细胞株SGC-7901、A549和HCT116细胞的迁移及侵袭能力。　　 5、在SGC-7901，A549和HCT116细胞中，CL14能够抑制HGF/c-Met/PAK4/LIMK1和HGF/PAK4/SCG10信号通路的活性。　　 6、在SGC-7901，A549和HCT116细胞中，CL14能够抑制PAK4/ERK和PAK4/c-SRC信号通路的活性。　　 7、CL14并不抑制PAK4高表达肿瘤细胞株SGC-7901、A549和HCT116细胞的增殖。　　 结论:　　 1、PAK4激酶磷酸化微管不稳定因子SCG10第50位丝氨酸促进胃癌细胞侵袭和转移。　　 2、CL14是PAK4激酶的新型小分子抑制剂。　　 3、CL14通过抑制HGF/c-Met/PAK4/LIMK1/SCG10和PAK4/ERK/SRC通路，抑制PAK4高表达肿瘤细胞迁移侵袭能力。