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肺炎克雷伯菌（klebsiella pneumoniae,KP）易在人体呼吸道和肠道中定殖,目前最流行的两个致病型分别是经典肺炎克雷伯菌（classical Klebsiella pneumoniae,c KP）和高毒力肺炎克雷伯菌（hypervirulent Klebsiella pneumoniae,hvKP）。c KP是一种条件致病菌,通常感染免疫力低下、患有疾病的人群。而hvKP则比c KP毒力显著增强,可以感染健康个体,易引发多种临床症状并可危及生命。近年来这两种菌株的边界越来越模糊,关于高毒高耐药菌株（multidrug-resistant hypervirulent Klebsiella pneumoniae,MDR-hvKP）的报道呈上升趋势。如2016年浙江大学附属第二医院五名外科手术患者,在入住重症监护室期间先后感染ST11型产碳青霉烯酶类的hvKP,最终因对多种抗生素治疗无效死于重症肺炎、多器官衰竭和脓毒血症。随着此类菌株的广泛检出和传播,该菌将严重危害患者的生命健康,并对公共健康造成难以预测的威胁。因此,本研究拟解析高毒力肺炎克雷伯菌的吸入感染毒理特性及其宿主免疫应答特性,为后续开发针对性疫苗与药物,有效控制高毒力肺炎克雷伯菌、以及高毒力高耐药肺炎克雷伯菌的感染与传播奠定基础。本研究首先构建了hvKP液体气溶胶肺递送感染小鼠模型。不同剂量的hvKP标准株NTUH-K2044通过手持式气溶胶肺递送装置生成液体气溶胶并被递送至C57BL/6J小鼠肺部,根据生存曲线计算得出其LD50约为200 CFU。随后采用100×LD50对小鼠进行气溶胶肺递送攻毒,通过临床观察发现小鼠在攻毒后第三天出现大量死亡;通过组织病理学分析发现hvKP攻毒12 h后小鼠肺部细小支气管周围有大量中性粒细胞浸润,且随着时间推移浸润加剧,到60 h其肺泡腔内充满粘液,部分区域肺泡壁断裂;脾病理切片发现感染36 h髓质内淋巴细胞明显减少,到60 h可见被膜下淋巴样细胞增生。而心脏、肝和肾没有明显病理改变。通过脏器载菌量检测发现,攻毒后肺脏中细菌从6 h开始升高,随后呈指数倍数上升,攻毒36 h后肝脏中、攻毒48 h后血液、心、脾和肾中开始有hvKP菌落检出。由上述结果可知小鼠吸入感染模型构建成功。随后通过高通量液相芯片检测技术和流式细胞技术,研究了小鼠吸入感染后体内蛋白水平和细胞水平的免疫应答动态变化规律。先后检测了100×LD50hvKP气溶胶肺递送攻毒小鼠后不同时间点的血清与肺灌洗液中多种细胞因子、以及肺中重要细胞群。结果表明小鼠肺内GM-CSF、GRO-α、TNF-α、IP-10、MIP-1β、IL-6、MIP-2在感染后6 h开始显著升高,IL-9、G-CSF、IL-1β、RANTES、LIF、IL-22、IFN-γ、IL-17A从感染后24 h开始显著升高;血清中细胞因子的升高主要集中在感染后48 h,升高的有IL-9、G-CSF、IL-18、IL-10、GRO-α、TNF-α、IP-10、MIP-1β、IL-6、MIP-2。攻毒后小鼠肺部中性粒细胞比例在12 h开始上升,到24 h后趋于稳定。肺泡巨噬细胞、自然杀伤细胞、B细胞和T细胞随着感染后细胞占比全部呈现下降趋势。而间质巨噬细胞、树突状细胞、上皮细胞和内皮细胞的细胞占比没有显著变化。上述结果提示小鼠肺部发生了剧烈的炎症反应。接下来通过单细胞转录组技术,从转录组水平对肺脏主要细胞群的变化趋势和细胞内基因表达情况进行了分析。结果表明,中性粒细胞和单核细胞的数量从感染后12 h开始迅速上升,至感染后48 h单核细胞数量保持稳定,中性粒细胞至感染后60 h数量依旧升高;肺泡巨噬细胞在感染后呈现上升趋势,在48 h数量开始下降;B、T和NK细胞在感染后数量呈下降趋势;而DC细胞呈先增高后下降的趋势。深入分析高通量液相芯片检测显著变化的蛋白,发现IL-18主要在肺泡巨噬细胞和间充质细胞中表达,在感染后48 h表达量最高;IP-10在多种细胞中都有较高表达,尤其是单核细胞、间充质细胞和肺间质巨噬细胞,表达量在24 h达到峰值;GM-CSF主要在上皮细胞中表达,表达量较低,随着感染呈上升趋势;TNF-α由中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞表达,肺泡巨噬细胞表达量最高,在感染后48 h达到峰值;IL-17总体表达量较低,表达集中在上皮细胞和T细胞,在感染后24 h表达量较高;IL-10表达量总体偏低,主要在中性粒细胞和单核细胞表达,在感染后60 h达到峰值;IL-6表达主要集中在成纤维细胞和间充质细胞,表达量随着感染逐渐升高;IL-1β总体表达量很高,各类细胞都可以进行分泌,感染后基因表达集中在中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞,表达量呈现逐步升高趋势。最后对转录组水平、细胞水平和蛋白水平的数据进行综合分析,发现GRO-α、IL-18、MIP-1α、MCP-1、IP-10、GM-CSF、TNF-α、IL-6、IL-17、IL-10、IL-1β的基因表达趋势和蛋白表达趋势相一致;中性粒细胞总体呈升高趋势,肺泡巨噬细胞、自然杀伤细胞以及B细胞和T细胞呈降低趋势,其细胞水平和基因表达水平检测结果都保持一致。综上所述,本研究构建了高毒力肺炎克雷伯菌气溶胶感染的小鼠模型,并对小鼠感染后体内的多种细胞因子在蛋白水平和基因表达水平的变化趋势进行了系统的展示,同时对固有免疫细胞的变化趋势和参与的功能进行了全方位的描述。这些工作的完成,为深入解析hvKP致病机理提供了详实的数据参考,同时也为后续解决高毒力高耐药细菌感染与传播奠定了基础。