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本实验以溪荪(Iris sanguinea)和白花溪荪(Iris sanginea f.albiflora)为研究材料,首先对从国外引进的用于mRNA直接提取的固相基因提取技术进行研究优化;其次,根据溪荪转录组数据库,运用RT-PCR方法从花瓣中分离出ANS、DFR、3GT基因,并对其进行生物信息学分析;最后将优化后的固相基因提取技术应用到ANS、DFR、3GT基因表达特性分析中探究花色呈色调控相关机理,其研究主要成果如下:(1)优选出价格便宜且操作更加简便快捷的国产探针(0.16*7mm,06Cr19Ni10)替代进口探针(0.14*6mm,0Cr18Ni9)应用于固相基因提取技术,并发明了探针处理使用的新型玻璃瓶固定架(专利号为ZL201720392787.X)和新型探针放置架(专利号为ZL201720192234.4)两项实用新型专利,其优化后的操作流程为:探针的预处理:依次用适量正丁烷、丙酮、乙醇分别清洗探针15min,80℃烘干箱烘干,之后加入固定比例的(3-糖氧丙基)三甲氧基硅烷、二甲苯、二异丙基乙胺混合液于80℃烘干箱孵化培养4h;探针的包埋:用适量乙酸乙酯清洗孵化培养后探针3次,每次约5min,探针自然干燥后放入装有20μl 3μM的Oligo dt25溶液的PCR管中,37℃水浴4h,之后用4-5ml50℃高压灭菌水清洗探针3次,每次5min,将探针置于探针放置架上自然干燥;探针的保存:将干燥后的探针置于PCR管中,放入封口袋并抽真空,置于4℃冰箱可保存21d;植物RNA提取:将探针扎入植物组织材料1-2mm,2min后拔出探针置于装有适量DEPC水的PCR管中,80℃水浴洗脱1Omin后取出,提取RNA即溶解于DEPC水中,将其保存至-80℃冰箱备用。(2)克隆了溪荪花色相关的IsANS1、IsDFR1、Is3GT1基因。利用溪荪转录组数据库筛选的ANS、DFR、3GT基因序列设计特异性引物,用改良的CTAB法从溪荪蓝花中提取总RNA,通过RT-PCR技术得到ANS、DFR、3GT三个基因,分别命名为IsANS1、IsDFR1、Is3GT1,三者均具有完整的开放阅读框,长度分别为1113bp、1071bp、1452bp。(3)IsANS1基因生物信息学分析表明:IsANS1基因编码氨基酸370个,氨基酸组成种类20,富含Glu(谷氨酸)、Leu(亮氨酸)、Val(缬氨酸)和Lys(赖氨酸),不含Pyl(吡咯赖氨酸)和Sec(硒半胱氨酸),蛋白相对分子质量为41.44kDa,理论等电点5.65,为亲水性蛋白,含有一个由2-O-酮戊二酸和Fe(Ⅱ)-依赖的氧化酶超家族组成的20G-FeII_Oxy功能结构域,其中2-O-酮戊二酸的活性结合位点为Arg(精氨酸)和Ser(丝氨酸),Fe(Ⅱ)离子活性结合位点为His(组氨酸)和Asp(天冬氨酸);IsANS1编码的氨基酸序列与鸢尾属的荷兰鸢尾(Iris x hollandica)同源性最高达90%,与葡萄风信子(Muscari armeniacum)、美丽百合(LiliuM speciosum)、鹤望兰(Strelitzia reginae)、郁金香(Tulipa fosteriana)等植物的同源性也在71%-80%之间。(4)IsDFR1基因生物信息学分析表明:IsDFR1基因编码氨基酸356个,氨基酸组成种类20,富含Val、Ala(丙氨酸)、Glu和Leu,不含Pyl和Sec,蛋白相对分子质量为39.49kDa,理论等电点5.72,为亲水性蛋白,其N末端存在一个由21个氨基酸组成的NADPH结合位点和由26个氨基酸残基组成的底物特异性结合区,属于NADB-rossmann超家族,其底物特异性结合位点为第130位的Asp,催化的底物为二氢杨梅黄酮(dihydromyricetin,DHM);IsDFR1基因编码的氨基酸序列与鸢尾科的荷兰鸢尾、小苍兰(Freesia hybrid cultivar)的同源性分别为90%和82%,与美丽百合、姜荷花(Curcuma alismatifolia)、郁金香等植物的同源性在72%-77%之间。(5)Is3GT1基因生物信息学分析表明:Is3GT1基因编码氨基酸483个,氨基酸组成种类20,富含Ala、Val、Leu、Ser和Glu,不含Pyl和Sec,蛋白相对分子质量为52.69kDa,理论等电点5.61,为亲水性蛋白,在其C-端含有由44个氨基酸构成的“PSPG”box,属于UDP-葡萄糖基转移酶家族(GTB-型),糖供体为UDP-葡萄糖;同源性分析显示Is3GT1基因与海枣(Phoenix dactylifera)、桑红叶(Musa acuMinata subsp.malaccensis)、草莓(Fragaria vescasubsp.vesca)等植物 3GT 序列同源性均在 44%以上。(6)通过验证表明改良的SPGE技术(NSPGE)可应用于IsANS1、IsDFR1、Is3GT1基因表达定量分析研究,结果显示:IsANS1和IsDFR1基因在溪荪和白花溪荪叶中的表达量随叶的生长而逐渐降低,而Is3GT1基因随叶的生长无明显变化;三个基因在溪荪与白花溪荪花中表达量均先升高后降低,其中IsANS1和Is3GT1基因表达量在盛开期最高,衰败期最低,而IsDFR1基因表达量在溪荪花中盛开期最高,在白花溪荪中初开期最高,都在衰败期最低;IsANS1和IsDFR1基因在溪荪和白花溪荪花中表达量均明显高于同期的叶,且在溪荪花中表达量明显高于在白花溪荪花中的表达;而Is3GT1基因在溪荪和白花溪荪叶中表达量高于同时期的花,在白花溪荪花中表达量高于在溪荪花中的表达,其结果与转录组数据结果一致。这表明IsANS1和IsDFR1基因与花色苷合成密切相关,Is3GT1可能没有参与到花色苷合成代谢途径中,而参与了其他次生代谢产物的糖基化修饰的反应。