第一部分电子显微镜观察521例扁桃体炎患者细菌感染状态的研究目的:慢性扁桃体炎是困扰人类的重要疾病之一,它可以引起全身多种并发症。在传统治疗中,抗生素一直被视为药物治疗的主要组成,但仍有众多患者因不能有效控制感染而选择切除扁桃体,为了评估抗生素对扁桃体炎的影响,以及慢性扁桃体炎的细菌感染情况,我们选择在进行规范抗生素治疗无效后行手术治疗的患者的扁桃体样本进行电子显微镜多方面观察,评估常规应用抗生素后扁桃体细菌感染情况,找到一种可靠可行的扁桃体细菌检测手段,同时通过对细菌侵染深度及形成生物膜的程度评估,以求指导临床治疗。方法:纳入标准:扁桃体肥大超过Ⅱ度,并伴有睡眠呼吸暂停(AHI>5)或反复扁桃体发炎。所有患者均接受规范的临床抗生素治疗并停药观察一周无复发,在所有临床急性炎症症状消失,血液分析指标正常的情况下方可手术并收入本研究。排除标准:年龄<3岁或>60岁;病理检查发现肿瘤表现;仍有咽痛、咽部不适症状;口腔及咽腔有急性炎症;自身免疫缺陷患者。取材:常规等离子切除的扁桃体组织,离体扁桃体置于50ml无菌生理盐水中冲洗扁桃体表面,利用液体收集装置将冲洗液收集至50ml离心管内。备用。无菌生理盐水冲洗扁桃体隐窝,收集冲洗液至50ml。冲洗之后迅速于手术台上取扁桃体隐窝上皮组织3*3mm,2块,分别编号1、2号,取1号组织块常规扫描电镜制备,于sigma-300扫描电镜下观察拍照。取2号组织块常规透射电镜制备,JEOL-1200EX透射电镜观察,MORADA-G2记录。记录样本的性别、年龄、各观察部位有无细菌,有无生物膜等,采用spss19.0软件对现有数据进行统计分析,按照观察部位不同将数据分成四组,进行统计比较分析。分析不同性别、年龄患者扁桃体细菌感染及感染部位存在的差异,此处观察细菌感染不区分细菌种类,只计算是否有细菌存在。记录各观察部位组细菌阳性概率,并相互比较。把四种检查均没有检测出细菌的病例作为“无感染者”,将其他病例作为“感染者”,对四种检测部位进行分析。判断灵敏度、假阳性率等。并对四种检测部位进行一致性分析。统计不同情况下四组各自有无细菌的排列组合,并对排列组合得出的结果进行分析。统计方式计数资料采用卡方检验及一致性分析等。结果:形态学结果:透射电镜下观察到扁桃体隐窝内见大量细菌生长,见细菌有生物膜形成,细菌侵袭至上皮细胞内,并在隐窝上皮细胞下也可以见细菌侵入。扫描电镜下见到隐窝表面有细菌生长,散在分布于隐窝上皮表面,并根植于上皮内。周围上皮结构清晰可见。深部冲洗液中可见较多细菌聚集,细菌形态清晰可见,有脱落细胞散在其中。表面冲洗液中见细菌聚集,细菌形态清晰可见,数量较深部冲洗液少,有较多脱落细胞及分泌物或坏死物覆盖其上。透射电镜观察隐窝上皮不同深度,可见扁桃体隐窝至黏膜下层不同深度细菌表现,可见细菌于隐窝处最多,而进入黏膜后便不断减少。细菌侵袭的主要场所在隐窝内及黏膜下层。细菌自隐窝表面至深部逐渐减少,可见隐窝内细菌有生物膜形成。生物膜不仅环绕细菌表面还穿插于细菌之间,作为细菌在隐窝中排布的基质。较少细菌情况下,观察隐窝上皮,当较少的细菌存在下,未见到典型的生物膜形态存在,但当有较多的细菌侵入细胞内,并有大量巨噬细胞出现在隐窝中。扫描电镜下扁桃体外表面表现,扁桃体表面细胞排列紧密,有散在细菌分布其表面,嵌于细胞间。扫描电镜下放大12000倍见单个细菌位于细胞表面。数据结果:四种不同部位及观察方式的表现。四种部位不同细菌表现的排列组合,可见四种部位细菌之间是否存在相互依存的关系。基本数据分析,四种检查区域全部阴性的样本量为36例,细菌感染率为93.09%。其中透射电镜观察扁桃体实质内检出菌率为70.63%,扫描电镜观察扁桃体隐窝上皮表面检出菌率为61.04%,扫描电镜观察隐窝内冲洗液检出菌率为87.52%,扫描电镜观察扁桃体表面冲洗液检出菌率为58.73%。进行两两比较后得知,隐窝内冲洗液的检出率显著高于其他三项。性别与年龄在不区分细菌种类的情况下,感染细菌率的比较,P>0.05,无统计学差异,年龄与性别对各部位的感染率无明显影响。对四种检测部位进行准确率分析,做“ROC曲线”,从曲线可知扫描深部冲洗液的诊断效果最好。各检查与金标准相比的灵敏度、特异度、假阳性率、假阴性率,四种检测手段的特异度均为100%,而灵敏度依次为扫描电镜观察深部冲洗液>透射电镜观察扁桃体实质>扫描电镜观察扁桃体实质>扫描电镜观察表面冲洗液。四种不同部位检测细菌方式的一致性分析。四种检查诊断细菌感染的结果具有一致性,但一致性不高。经过分析4个部位出现细菌的排列组合,有8种可能性样本为0,分别是D、只有表面冲洗液有菌而扁桃体隐窝或实质内无菌的情况不存在。F、实质与表面有菌,隐窝内无菌的情况不存在。G、只在隐窝表面有菌的情况不存在。J、除深部冲洗液以外均能检测到细菌的情况不存在。L、除实质内以外均能检测到菌的情况不存在。M、实质内和表面有菌,冲洗液无菌的情况不存在。N、冲洗液有菌,实质内或表面无菌的情况不存在。0、表面冲洗液有菌,实质表面有菌,但实质内和深部冲洗液无菌的情况不存在。存在必然联系情况的是1、当隐窝黏膜表面有菌时,深部冲洗液必然有菌,未检测到无菌情况。但是种情况下,透射电镜观察实质及表面冲洗液均有未检出菌的情况发生。2、表面冲洗液发现细菌时,深部冲洗液必然发现细菌,但是深部冲洗液有菌时表面冲洗液未必有菌。3、当深部冲洗液无菌的时候只有透射电镜下实质内有菌存在的情况。其余皆无细菌检出。结论:1、在抗生素经验用药后,即使临床症状消失,扁桃体仍然存在大量细菌生存的情况。2、四种部位在相应电镜下的表现各有特点,深部冲洗液可以有效的反应扁桃体细菌感染的程度。3、生物膜对扁桃体细菌侵袭的程度有重要影响。4、外部细菌感染是扁桃体细菌感染的最重要因素,细菌感染的过程存在由外及内的过程。5、细菌可以只存在于扁桃体上皮细胞内,从而可以躲过大多数常见抗生素的攻击。第二部分60nm免疫胶体金技术检测金黄色葡萄球菌及甲型溶血性链球菌的研究目的:上文我们已经证明深部冲洗可以很好的体现扁桃体细菌感染的情况,那么找寻一种能够更好更快的检测细菌种类且方便可靠的方式就显得尤为重要了。18nm胶体金标记技术已经比较成熟,但是由于体积小不易观察,双抗反应时间长、干扰因素多等问题,临床应用一直不理想,所以我们期望通过新的60nm免疫胶体金一抗标记技术实现临床对扁桃体冲洗液中细菌种类的快速诊断。方法:制备标准菌溶液。我们选取了扁桃体感染最常见的细菌金黄色葡萄球菌及危害最大的细菌甲型溶血性链球菌为实验对象。取BNCC186335,金黄色葡萄球菌,BNCC102663,甲型溶血性链球菌组,分别培养于细菌培养皿中,经培养,达对数生长后,超净工作台下,无菌取菌环取菌适量,共分15组样本,2%PFA溶液中,混匀,固定1小时,每组平均分成6份。制备60nm胶体金抗体溶液。胶体金原液(胶体金,稳定剂为乙二醇)1ml浓度约为40ug/ml,一抗(0.1mg/ml)=100ug/ml。分别取1ml胶体金原液与10ul的一抗反应。置于4°恒温冰箱中摇匀反应12小时,观察无沉淀后备用。18nm与60nm胶体金分别标记标准菌溶液。将标准菌液5000r/min离心,5分钟,去上清。置于BSA溶液中,37℃封闭1小时。然后PBS冲洗5分钟,5000r/min离心,5分钟,重复三遍,去上清。6份离心沉淀随机分成两组,金黄色葡萄球菌组和甲型溶血性链球菌组,随机编号1、2、3号。将1号置于60nm胶体金结合好的相应抗体溶液中,而2号则放置于无胶体金结合的一抗溶液中,3号样本放入仅含金颗粒的溶液中。37℃孵育1小时,之后PBS冲洗,5000r/min离心,5分钟,去上清,重复三遍。1、3号扫描电镜组织制备。2号样本,放入BSA溶液中,37℃孵育1小时。PBS冲洗,5000r/min离心,5分钟,去上清,重复三遍。加入18nm胶体金颗粒结合的二抗溶液中,37℃孵育1小时,PBS冲洗,5000r/min离心,5分钟,去上清,重复三遍。扫描电镜组织制备。15组样本,6个标准菌沉淀,常规扫描电镜制备,sigma-300扫描电镜下观察拍照。对电镜图片进行观察分析。结果:15组样本,标准菌溶液样本中18nm和60nm两种胶体金溶液标记的细菌中均能见标记现象,而3号样本无抗体结合金颗粒并未特异性的附着于细菌上。标准菌溶液组实验过程自细菌溶液配好至镜下观察到清晰胶体金颗粒止,60nm与18nm胶体金颗粒标记平均耗时分别为6.25±0.15小时和8.23±0.19小时。观察胶体金免疫扫描电镜图片,可以观察到18nm胶体金颗粒在金黄色葡萄球菌及甲型溶血性链球菌中均有标记,呈散在分布,扫描电镜下可见细菌表面有较小亮点。放大倍数在100000倍,电压在10kv方能看清。而60nm胶体金颗粒在两种细菌表面也均有标记,放大50000倍,电压在3kv便清晰可见。结论:1、胶体金颗粒标记技术可以很好的标记金黄色葡萄球菌及甲型溶血性链球菌。2、一抗连接60nm胶体金较18nm胶体金双抗标记可以更清楚更快捷的标记两种细菌。3、60nm胶体金标记电镜技术可以作为诊断细菌感染的可靠稳定的技术。