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结直肠癌是最常见的恶性肿瘤之一,占消化道恶性肿瘤的第二位。结直肠癌治疗失败的主要原因是癌细胞发生了血行或淋巴转移。研究显示,结直肠癌的转移不仅与癌细胞的侵袭能力有关,还与肿瘤内血管、淋巴管的新生密切相关。大量资料表明,在人类结直肠癌中存在着血管、淋巴管的新生,而且血管、淋巴管的密度与肿瘤淋巴结转移及预后相关。抑制血管新生可以减少肿瘤的血供,诱导肿瘤细胞的凋亡,减少转移的机率;抑制淋巴管新生可以降低淋巴结转移率,改善预后。寻找有效的治疗靶点正在成为该领域的一个研究热点,其中肝细胞生长因子HGF尤其引人注目。肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor,HGF),又称离散因子(scatter factor,SF),是目前发现的具有最强活性的刺激肝细胞再生的细胞因子,曾误以为它就是特异性肝细胞生长因子。但实际上,它还对多种细胞具有促有丝分裂、促移动、促形态发生的活性。HGF发挥其各种生物学作用,主要通过其受体c-Met实现,c-Met为具有酪氨酸蛋白激酶活性的膜受体,由原癌基因c-met编码,属于肝细胞生长因子受体家族中的一员。已有研究证实HGF在肿瘤细胞的侵袭和转移过程中起重要作用,而且在血管形成中也发挥重要作用。最近有研究显示,HGF还是淋巴管生成的促进因子。而血管、淋巴管的新生与肿瘤的侵袭和转移密切相关。研究显示,血管和淋巴管的形成是由内皮细胞的增殖、移行和成管等若干步骤组成的。但迄今,HGF在淋巴管形成过程中的作用及机制尚不清楚,HGF在人结直肠癌血管、淋巴管新生中的作用机制尚缺乏系统的研究。血管内皮生长因子(VEGF)家族中的VEGF-A是肿瘤血管生成的重要因子;而VEGF-C和VEGF-D则是肿瘤淋巴管新生和淋巴结转移的重要调控因子。所以,探索肿瘤细胞如何调控VEGF家族的产生进而促进肿瘤细胞转移以及促进肿瘤血管、淋巴管生成就成为抗肿瘤脉管生成研究的重点问题。已有研究证实HGF可以上调结直肠癌VEGF-A的表达,但HGF能否调控结直肠癌细胞VEGF-C和VEGF-D的表达于国内外尚未见报道。本实验采用形态与机能相结合的方法系统检测HGF对人脐静脉内皮细胞ECV-304,人真皮淋巴管内皮细胞(HDLEC),人结肠癌细胞SW480、SW620的增殖、移行行为以及HGF对SW480,SW620的VEGF-A,VEGF-C,VEGF-D表达的影响,以期为结直肠癌抗脉管生成寻找治疗新靶点。本实验分两部分。一HGF对人脐静脉内皮细胞ECV-304、人真皮淋巴管内皮细胞(HDLEC)的增殖、移行的影响本实验采用MTT法分析HGF对细胞增殖的作用,流式细胞术检测HGF对细胞周期的影响,基底膜重建实验观察HGF对细胞移行的影响,透射电子显微镜观察加入HGF后细胞超微结构的变化。结果显示:HGF能促进ECV-304、HDLEC增殖。HGF对ECV-304的促增殖作用呈质量浓度依赖关系。而对HDLEC的促增殖作用并不随着HGF浓度的增加而增强。流式细胞术结果显示,与对照组相比,ECV-304和HDLEC的HGF组中的G0 /G1期细胞均减少,S期细胞增多,G2/M期细胞增多。ECV-304增殖指数由对照组的37.8%增至47.5%,HDLEC增殖指数则由对照组的27.3%增至37.1%。HGF也能促进ECV-304、HDLEC移行。HGF≥10ng/ml时能有效促进ECV-304移行并且呈质量浓度依赖关系;HGF能有效促进HDLEC移行且呈质量浓度依赖关系。透射电子显微镜观察ECV-304和HDLEC细胞的超微结构发现,加入HGF后,两种细胞内的微丝均增多。二HGF对人结肠癌细胞SW480和SW620的增殖、移行及VEGF-A、VEGF-C、VEGF-D表达水平的影响本研究采用MTT法分析HGF对细胞增殖的作用。流式细胞术检测HGF对细胞周期的影响。基底膜重建实验观察HGF对细胞移行的影响。透射电子显微镜观察加入HGF后细胞超微结构的变化。应用Western Blotting检测两种细胞有无c-Met的表达以及加入HGF前后VEGF-A、VEGF-C、VEGF-D表达水平的变化。结果显示,HGF能促进SW480和SW620增殖。HGF≥10ng/ml时开始促进SW480和SW620增殖,随着HGF浓度的增高SW620细胞增殖缓慢,但对SW480增殖作用不随着HGF浓度的增加而增强。流式细胞术结果显示,与对照组相比,SW480的HGF组中的G0 /G1期细胞减少,S期细胞增多,G2/M期细胞增多,但HGF对SW620细胞周期的影响不明显。SW480增殖指数由对照组的42.3%增至46.9%,SW620增殖指数由对照组的32.0%增至33.8%。HGF也能促进SW480和SW620移行,基底膜重建实验显示,HGF能明显促进SW480、SW620移行且呈质量浓度依赖关系。透射电子显微镜观察SW480和SW620细胞的超微结构发现,加入HGF后,两种细胞内的微丝均增多。Western Blotting结果显示,HGF的特异性受体c-Met表达于SW480和SW620细胞,加入HGF上调了SW480和SW620细胞的VEGF-A、VEGF-C、VEGF-D的表达水平。结论1 HGF可以促进人脐静脉内皮细胞ECV-304和人真皮淋巴管内皮细胞(HDLEC)的增殖和移行。HGF对二种细胞的促移行作用相似,均呈质量浓度依赖性,而促增殖作用有所不同。2 HGF可以促进人结肠癌细胞SW480、SW620的增殖和移行作用。HGF对二种细胞的促移行作用相似,均呈质量浓度依赖性,而促增殖作用有所不同。3 HGF可以上调SW480和SW620细胞的VEGF-A、VEGF-C、VEGF-D的表达水平。