研究背景:葡萄膜炎是指发生于虹膜、睫状体、脉络膜组织、玻璃体、视网膜及视网膜血管炎症的总称。葡萄膜炎的病因复杂,但以自身免疫紊乱所导致的葡萄膜炎最为常见,而自身免疫性葡萄膜炎比较常见为Behcet病和Vogt-小柳原田综合征。自身免疫性葡萄膜炎病情复杂、病程长、易反复发作、治疗困难,严重影响患者的视觉功能和生活质量。近年来,人们对葡萄膜炎的免疫发病机制进行了广泛的研究,发现多种抗原或自身抗原、天然免疫细胞、适应性免疫细胞和细胞因子均参与了葡萄膜炎的发病过程,其中CD4⁺T细胞,包括Th1、Th17、Th22和Treg细胞及其相关的细胞因子在葡萄膜炎的发病过程中起着关键作用。因此,从免疫学和分子生物学角度探究葡萄膜炎患者炎症性反应和适应性免疫系统调节机制,对寻找葡萄膜炎治疗的靶点具有重要意义。CD161分子是一种同型二聚体C型凝集素,这一表面分子最初被认为是在啮齿类动物NK细胞上表达的NKRP1糖蛋白的人类同源物,与啮齿类动物的同源物具有46%-47%的同源性。最近有研究证实CD161在人类T细胞中也有表达,在外周血淋巴细胞中,CD161不仅表达于CD4⁺TCRαβ⁺T细胞,还可以表达于CD8⁺TCRαβ⁺T细胞、CD4^-CD8^-TCRαβ⁺T细胞和CD4^-CD8^-TCRγδ⁺T细胞。CD161^intCD4⁺和CD161^highCD8⁺T细胞也已从胎儿脐带血（UCB）中分离出来,它们在脐带血中表现出幼稚表型。在存在Th17极化细胞因子培养的情况下,IL-17的产生仅限于CD161⁺CD4⁺CD45RA⁺部分,这意味着Th17细胞来源于CD161⁺CD4⁺T细胞的祖细胞。并且CD161分子可能作为IL-17产生的细胞标记物,参与了细胞免疫反应。已有大量研究表明CD161可以激活诱导T细胞扩增、CD161的多态性、可以识别CD161⁺T细胞上的其他受体等一系列功能,使得CD161分子有可能作为治疗多种疾病的潜在治疗靶点。cAMP反应元件调控因子α（CREMα）属于转录因子超家族中的一员。人类多于20种的CREM异构体是通过差异剪接过程、转录因子、启动子和启动密码子来实现的。CREM的表达通过组织细胞和发育特异性机制受到了严格的调控。因此,CREM介导的基因转录选择性表达在一些细胞中（如雄性生殖细胞、肾上腺细胞、垂体细胞和T淋巴细胞）并被人们广泛研究。人类T淋巴细胞主要表达CREMα这一亚型,最近的研究表明,CREMα可以激活CD4⁺T细胞中某些细胞因子基因的转录,还影响IL-17家族细胞因子的表观遗传修饰和转录调控。CREMα被认为是免疫细胞中组织特异性基因调控的中心贡献者。由此推测CD161分子和CREMα可能参与了自身免疫性葡萄膜炎的发病过程,两者可能存在着相互调控关系,并在自身免疫性葡萄膜炎发病中发挥着一定的作用。目的:本研究的目的是检测活动期葡萄膜炎患者外周血中T细胞表达CD161分子的水平,探讨CD4⁺CD161⁺T细胞的作用机制,并进一步研究CREMα与CD161分子表达水平之间可能的调控关系。方法:1.活动期葡萄膜炎患者外周血中T细胞表面CD161分子的分布与表达本研究以我国最为常见的葡萄膜炎类型BD和VKH患者作为研究对象。利用流式细胞术检测CD161分子在活动期BD和VKH患者治疗前后T细胞中的分布和表达,以无自身免疫性疾病的正常人作为对照。利用Luminex检测对照组和活动期BD和VKH患者治疗前后血清中IL-17A等细胞因子的表达情况。2.环孢素对CD161分子的作用和影响体外将环孢素与活动期葡萄膜炎患者和对照组的外周血单个核细胞共培养。利用流式细胞术检测环孢素作用前后活动期BD和VKH患者组和对照组T细胞中CD161分子的表达情况。利用Luminex检测环孢素作用前后活动期BD和VKH患者组和对照组细胞培养上清中IL-17A等细胞因子的表达情况。3.活动期自身免疫性葡萄膜炎患者中CREMα的表达利用免疫磁珠分选出活动期葡萄膜炎患者和对照组外周血中的CD4⁺T细胞,采用RT-qPCR法和Western blot法研究CD4⁺T细胞中CREMα、CD161、RORγt和IL-17A转录水平和蛋白水平的表达情况。4.CREMα对CD161分子表达的调控作用利用小干扰RNA技术,向活动期BD和VKH患者外周血CD4⁺T细胞中转染CREMαsiRNA以抑制CREMα的表达水平,利用RT-qPCR法和Western blot法检测CD161、RORγt和IL-17A mRNA和蛋白的表达变化。结果:1.CD161分子在CD3⁺、CD3⁺CD4⁺、CD3⁺CD8⁺T细胞中均有表达。活动期BD和VKH患者外周血中CD161⁺CD3⁺和CD161⁺CD3⁺CD4⁺T细胞比例显著高于对照组。活动期BD和VKH患者外周血中CD161⁺Th17细胞水平明显高于健康对照组和治疗后的患者组。进一步分析了对照组和活动期BD和VKH患者治疗前后外周血中CD4⁺CD161⁺和CD4⁺CD161^-T细胞分泌IL-17A的水平,结果显示CD4⁺CD161⁺T细胞分泌IL-17A的水平明显高于CD4⁺CD161^-T细胞。检测对照组和活动期BD和VKH患者治疗前后血清中IL17A等细胞因子的表达情况,结果显示活动期BD和VKH患者的IL-6、IL-17A、IFN-γ和TNF-α水平均高于健康对照组和治疗后的患者组。2.体外加入环孢素后可显著下调活动期BD和VKH患者组CD161的表达水平及Th17细胞的比例。同时也可显著下调对照组CD161的表达水平及Th17细胞的比例,因此其作用为非特异性。对照组和活动期BD和VKH患者组细胞培养上清中IL-1β、IL-2、IL-12p70、IL-17A、TNF-α、IFN-γ和GM-CSF等细胞因子的表达情况,同样显示环孢素可以非特异性降低这些细胞因子的表达水平。3.活动期BD和VKH患者外周血CD4⁺T细胞中CREMα、CD161、RORγt和IL-17A mRNA转录水平与蛋白表达水平均明显高于对照组和治疗后的患者组。4.向活动期BD和VKH患者的CD4⁺T细胞中转染CREMαsiRNA后,CREMα表达受到抑制,同时CD161、RORγt和IL-17AmRNA转录水平与蛋白表达水平也降低。结论:CD161分子在CD4⁺和CD8⁺T细胞中均有分布,在活动期自身免疫性葡萄膜炎患者外周血CD4⁺T细胞中高表达,并且CD4⁺CD161⁺T细胞与IL-17A的分泌有关,CREMα作为转录因子,参与了CD161、RORγt和IL-17A的表达调控,环孢素在控制临床炎症的同时,可以抑制CD161分子及Th17细胞的频率和细胞因子的表达,提示CD161分子或CREMα可作为治疗自身免疫性葡萄膜炎的新靶点。