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酰胺酶即酰胺水解酶,是一种能断裂非肽键型酰胺键的一种水解酶。酰胺酶具有较高的催化活性、严格的立体选择性和广泛的底物谱等特性,使得越来越多的研究集中于酰胺酶在手性农药、手性药物和手性氨基酸的合成中。L-草铵膦（L-PPT）是在吸水链霉菌中发现的一种天然产生的L型的含磷氨基酸,同时也是一种对环境无害的广谱型、触杀型、灭生性除草剂,具有重要的应用前景。与传统的化学法合成草铵膦相比,通过酰胺酶催化合成L-草铵膦的方法具有立体选择性好、反应条件温和、转化率高、后续分离纯化操作简便、环境友好等优势。本文通过产酶微生物菌株的筛选和酰胺酶基因挖掘等手段获得了具有较高活力的立体选择性的酰胺酶,并将其在枯草芽孢杆菌中实现了分泌表达,研究了其酶学性质,并通过定向进化的方法对其酰胺酶活力进行了改造,应用于L-草铵膦的合成中。主要研究内容如下:（1）立体选择性酰胺酶酶库的构建。建立了一个快速、高效、灵敏的高通量筛选方法用于催化生产草铵膦的相关产酶微生物及生物酶的筛选,运用此方法从土壤中筛选到了十株产酰胺酶的新菌株,其中有两株菌株具有产高活力、高立体选择性酰胺酶的能力:Kluyvera cryocrescens ZJB-17005和Leclercia adecarboxylata ZJB-17008。利用基因组狩猎及数据库挖掘技术获得了35个酰胺酶,构建了酰胺酶酶库。并从中筛选获得3株酰胺酶Kc-Ami、La-Ami和Bm-Ami均具有较高的催化活性和立体选择性。（2）建立了一个高效的枯草芽孢杆菌分泌表达体系用于酰胺酶的分泌表达。以Bm-Ami为报告基因,运用启动子工程技术成功从33个内源性的组成型启动子中筛选到6个启动酰胺酶表达的强度大于Pcdd的启动子,分别为PlytR、PspoVG、PaprE、PyvyD、PftsH、PamyE,其中PamyE作为启动子的酰胺酶具有最高的表达活力,是Pcdd的1.46倍。通过双启动子表达载体的构建与筛选,成功得到的双启动子PamyE-cdd具有最高的启动酰胺酶表达的强度,使分泌的活性重组酰胺酶的酶活升高为原始的2.63倍。同时,通过高分泌性能信号肽筛选,获得高分泌性能的信号肽Pac,成功构建高活力的枯草芽孢杆菌分泌表达体系,使Bm-Ami、Kc-Ami、La-Ami外分泌活性酰胺酶的活力分别提高到原始的3.58、3.02和3.12倍。（3）对Bm-Ami、Kc-Ami、La-Ami进行了分离纯化和酶学性质研究,得知Bm-Ami、Kc-Ami、La-Ami皆为异质二聚体,α和β亚基大小分别为:26和61 kDa、24和64 kDa、26和62 kDa,都属于N-端丝氨酸亲核水解酶家族的酰胺酶,三酶总体同源性较低,但都具有N端Serβ1与相关的氨基酸Alaβ69,Asnβ241（Bm-Ami为β244）,Glnβ23,Argβ263（Bm-Ami为β266）。酰胺酶Kc-Ami、La-Ami、Bm-Ami的最适pH均为8.5,最佳的缓冲液为Tris-HCl;最佳的温度分别55?C、50?C、55?C;50?C时,La-Ami、Kc-Ami、Bm-Ami的半衰期分别为19.8 h、59.1 h、47.6 h。动力学参数分析显示,Bm-Ami的催化效率最高,分别为La-Ami和Kc-Ami的2.24和1.72倍。同时通过底物谱分析与催化机制分析表明La-Ami、Kc-Ami、Bm-Ami均可应用于手性氨基酸合成。（5）利用同源建模及活性口袋预测分析的方法,通过突变文库的构建筛选及组合突变等方式,获得了活力提高的菌株,其中最优突变株mut-Rβ381F/Yβ382F的活力提高到原始野生型Bm-Ami的204%。将原始野生型（Bm-Ami）及相应的突变型酰胺酶分别进行表达和纯化,分别测定这些酰胺酶在催化rac-S合成L-草铵膦过程中的动力学参数。结果显示活力提高的菌株,催化效率相较于野生型都有所提高,其中最优突变株mut-Rβ381F/Yβ382F的催化效率是原始野生型Bm-Ami的2.84倍。利用同源建模和分子对接的方法分析了双突变株mut-Rβ381F/Yβ382F与原始野生型Bm-Ami结构上的差异,结果表明突变后的mut-Rβ381F/Yβ382F使底物羰基更靠近催化残基,缩短了作用距离,同时突变后氨基酸使活性口袋与底物侧链识别处变大,更利于底物的进入和产物的释放,因而更易于反应发生。（6）选用立体选择性酰胺酶Bm-Ami的最优突变体mut-Rβ381F/Yβ382F为生物催化剂,对催化rac-4-[羟基（甲基）膦酰基]-2-（2-苯乙酰基）-丁酸（rac-S）合成L-草铵膦的催化条件进行了研究。催化反应的最适pH为9.0（氨水调节）,最适温度为55?C,酰胺酶的添加量为15μg mL-1(753.3 U L-1)。最适反应条件下底物浓度为500 mM时,反应2 h,转化率到达49.2%,e.e.值达到99.9%,时空产率584.52 g L-1 d-1。底物浓度为600 mM时反应受到抑制,转化率降低。对酶催化反应合成草铵膦的反应液经过预处理、离子交换树脂分离、重结晶分离后得到了L-PPT的纯度为99%,e.e.值为99.9%,收率为90%。同时对D-4-[羟基（甲基）膦酰基]-2-（2-苯乙酰基）-丁酸（D-S）进行了消旋化处理,消旋化后得到的rac-S可进一步用于酶催化反应。