碳纳米管具有特殊的力学、光学、电学和生物效应受到了广泛的关注。近年来，修饰技术的发展使碳纳米管在生物医学领域显示出巨大的应用潜力，因此相关的生物安全性评价意义重大。目前，关于碳纳米管毒性的研究主要集中在呼吸毒性研究，免疫相关生物效应和免疫毒性研究的资料较为有限，限制了其在生物生物医学领域的进一步应用。　　 出于上述考虑，我们通过化学修饰的方法获得了不同表面性质的碳纳米管，对修饰前后的碳纳米管进行较为系统的免疫毒性和免疫相关的生物效应研究，从蛋白、细胞和整体动物水平，考察不同表面性质的碳纳米管生物免疫相关生物效应和安全性，并比较不同表面修饰碳纳米管的毒性效应，研究化学修饰与碳纳米管的生物相容性之间的关系和影响规律。研究主要分为四个部分:　　 1.利用化学修饰的方法获得水分散性良好的功能化多壁碳纳米管(MWCNTs)MWCNTs-COOH和MWCNTs-PEG。并通过红外线光谱分析(FTIR)、X射线衍射能谱(XPS)、热重分析(TGA)、透射电镜(TEM)和电感耦合等离子质谱(ICP-MS)等手段进行材料表征，在此基础上分析了三种碳管(p-MWCNTs、MWCNTs-COOH和MWCNTs-PEG)在体内外染毒体系中的分散状态。　　 2.以RAW264.7细胞为体外免疫毒性研究模型，研究了三种不同类型的MWCNTs对细胞活力，细胞膜完整性、细胞摄取、细胞内活性氧(ROS)生成、细胞凋亡发生和炎症反应发生的影响及剂量—效应关系，在此基础上进一步研究MWCNTs引起细胞免疫相关毒性效应的分子机制。并结合MWCNTs自身性质特点，分析了不同类型纳米材料引起生物效应和毒性效应的差异产生的原因。　　 3.本研究主要参照ICHS8指导原则，以BALB/c小鼠为模型动物，研究了p-MWCNTs和MWCNTs-PEG经尾静脉多次注射后引起小鼠免疫应答及免疫毒性效应。观察了免疫病理学相关的常规血液学、血生化指标、血清免疫球蛋白含量、免疫器官的重量、免疫器官的病理改变和电镜观察、外周血细胞表型分析以及与免疫功能相关的体液免疫功能、细胞免疫功能和NK细胞功能变化。在免疫毒性剂量—效应关系研究的基础上，对相同剂量下p-MWCNTs和MWCNTs-PEG引起免疫毒性的差别进行了比较分析。　　 4.以牛血清白蛋白(BSA)和免疫球蛋白(IgG)作为模型分子，研究了不同类型的MWCNTs对蛋白质分子的作用。在研究MWCNTs对BSA和IgG吸附作用的同时，探讨了MWCNTs对水溶液中未被吸附的BSA和IgG分子结构的影响，采用稳态荧光光谱分析了蛋白分子的淬灭，用圆二色谱(CD)检测了蛋白分子二级结构组分的变化。在此基础上比较和分析不同类型MWCNTs对同种蛋白分子的影响以及同一类型MWCNTs对不同蛋白影响的差异。　　 取得的主要研究结果如下:　　 1.通过FTIR、XPS和TGA分析证明了COOH和PEG基团成功接枝在MWCNTs的表面。利用TEM、ICP-MS和DLS对三种p-MWCNTs、MWCNTs-PEG和MWCNTs-COOH进行表征，三种MWCNTs形态上差异不明显，有着相似的直径和长度，p-MWCNTs易于缠结或成束，修饰后的MWCNTs分散较好;三种MWCNTs的金属杂质含量均较低（1％左右），且没有差异;MWCNTs分散在含血清培养基中均带负电。稳定性研究表明三种MWCNTs在体内外染毒体系中的稳定性表现基本一致，稳定性大小依次是MWCNT-PEG＞MWCNT-COOH＞p-MWCNTs。　　 2.体外研究表明:p-MWCNTs引起明显的细胞增殖抑制和细胞膜损伤，MWCNTs-COOH引起细胞内活性氧(ROS)含量的明显升高，炎性细胞因子(IL-1、IL-6、TNF-α)释放增加和iNOS和炎性相关基因表达增加，三种MWCNTs均未引起明显的细胞凋亡的发生;MWCNTs-COOH抑制细胞生长的机制与普通未修饰的MWCNTs有很大差别，修饰前表面性质不相同的MWCNTs在金属杂质含量无差别情况下，ROS的产生与炎症反应的发生强度与细胞摄取材料的数量呈正相关。　　 证明了MWCNTs通过对线粒体结构的破坏，引起线粒体功能障碍，诱发细胞内ROS生成增加，并激活MAPKs和NF-κB信号通路，引起下游炎症因子生成，引发一系列炎症反应的作用机制。更重要的是，基于该机制提示表面功能化修饰改变MWCNTs的水溶性的同时，修饰基团表面性质引发的细胞摄取能力增加可能引起不易被观察到的毒性反应，进而引发潜在的负效应。为进一步毒性研究可以以此为出发点研究与毒性效应相关的上游通路激活，在此基础上对MWCNTs进行功能化修饰，最终达到调控MWCNTs巨噬细胞免疫毒性的目的。　　 3.体内研究表明p-MWCNTs引起小鼠脾脏和胸腺脏器系数明显升高;p-MWCNTs和MWCNTs-PEG染毒后28d并未被完全清除，肺脏和肝脏中仍有碳管累积，肺部有慢性炎症反应和肉芽肿的形成。电镜观察淋巴细胞线粒体损伤明显;血液学检查中p-MWCNTs和MWCNTs-PEG导致白细胞分类中淋巴细胞百分比的升高;p-MWCNTs改变了外周血液CD4+T和CD8+T淋巴细胞的数量，CD4+/CD8+在低剂量升高，在高剂量明显降低，且有一定剂量—效应关系。　　 对特异性免疫功能而言，p-MWCNTs的小鼠体液免疫功能较细胞免疫功能的影响明显，因此推测MWCNTs对小鼠免疫功能的影响以体液免疫为主;p-MWCNTs和MWCNTs-PEG均不引起小鼠NK细胞功能的改变，引起非特异性性免疫反应为注射部位(尾静脉周围)MWCNTs被巨噬细胞吞噬。使用PEG修饰降低了小鼠网状内皮系统对MWCNTs-PEG的识别和摄取，明显改善了MWCNTs引起的特异性和非特异性免疫应答的发生，对免疫功能的影响明显降低。　　 研究揭示了p-MWCNTs在正常小鼠体内免疫应答的剂量—效应关系，在低剂量(0.02mg/kg)时表现为轻微的免疫激活，当剂量＞0.5mg/kg时，表现出明显的免疫抑制，且免疫抑制以对外周血淋巴细胞分类数的改变和体液免疫功能的抑制为主。无免疫原性的PEG修饰后的碳管在染毒后28d并未被完全清除，肺脏中仍有少量累积，未出现出相同剂量p-MWCNTs注射后的免疫功能抑制，但仍能观察到肺部明显的慢性炎症反应和肉芽肿的形成。研究结果对碳纳米管免疫毒性作用评价生物学具有重要意义。　　 4.三种MWCNTs对两种蛋白分子具有瞬间吸附明显增加和动态吸附平衡的特点。吸附量趋势一致，吸附能力大小依次为:p-MWCNTs＞MWCNTs-COOH＞MWCNTs-PEG。不同MWCNTs对蛋白的吸附能力取决于表面修饰基团的性质;相同表面性质的MWCNTs对蛋白分子的相互作用主要由蛋白分子表面的疏水性氨基酸的比例、蛋白分子的等电点和溶液的PH值，以及相作用碳管表面的电荷和修饰属性共同决定，吸附量与疏水性氨基酸比例呈反比。MWCNTs对BSA和IgG分子的结构影响主要表现为荧光淬灭和蛋白次级结构中α-螺旋的丢失和β-转角含量的增加，这一变化将改变BSA和IgG的相关功能，进而显示出一定的生物毒性。PEG修饰的MWCNTs在对免疫相关蛋白分子的研究表现出了良好的生物相容性，为生物医学领域的推广应用奠定了良好的基础。　　 研究揭示了功能化纳米材料的蛋白结合能力和对蛋白结构影响的规律。这些规律的发现对纳米材料生物效应提供了理论解释，阐明了在体内外研究中纳米材料与蛋白分子生物行为的可能过程和潜在影响，为毒性研究结果的解释提供了有价值的参考数据。同时为PEG修饰降低纳米材料毒性、提高生物相容性提供了方法学上的参考，为PEG修饰的纳米材料的生物安全性提供了理论支持。