1研究背景新生儿缺氧缺血性脑损伤(hypoxic ischemia brain injury,HIBI)仍然是婴幼儿急性死亡率和慢性发病率的重要原因,据估计缺氧缺血脑损伤的发生在发达国家大约是每1000名出生的足月新生儿中有大约2-4名,发展中国家是其20-30倍,甚至更高。此外25%的会出现严重的,永久性神经心理后遗症,包括如智力落后、视觉运动障碍、视觉感觉障碍、多动、脑瘫、癫痫等。尽管新生儿医疗保健不断发展,HIBI病理生理机制的研究在不断增加,但缺氧缺血仍持续导致显著的长期神经功能障碍或死亡。出生窒息的新生儿每年估计约1百万或占全世界新生儿死亡的23%。HIBI是一个渐进的过程,大量的证据显示不成熟和成熟脑组织对脑损伤的病理和后果存在明显不同。神经元之间的连接以突触为主,而胶质细胞之间多通过缝隙连接(gapjunction,GJ)进行信息的传递,其中星型胶质细胞通过GJ高度联系的,允许细胞外K+、H+、谷氨酸和其他物质的空间缓冲。星型胶质细胞表达的连接蛋白43(connexin,Cx43)及其半通道(hemichannel,HCl)在神经系统疾病中得到越来越多的探索,为我们研究HIBI的发病机制和治疗带来新的视野方向。与神经元相比,星型胶质细胞组成了脑内细胞的种群,能够表达最高数量的缝隙连接蛋白,称为连接蛋白(connexin,CX)。由连接蛋白组成的六聚体结构,称为连接子。由同种连接蛋白组成的连接子为同聚体连接子,不同种连接子组成异聚体连接子。相邻的细胞膜对应面上的一对连接子组成缝隙连接通道。同聚体连接子构成同型缝隙连接,异聚体连接子参与构成异型缝隙连接。连接蛋白是跨膜蛋白,形成细胞间两种不同的通讯途径。一种途径涉及缝隙连接通道(gap junction channel,GJC)定位于相邻细胞之间,允许直接的细胞与细胞间离子和小分子的传递。另一种途径是通过半通道定位于非对向的细胞面,允许细胞内和细胞外区域的交换,包括自分泌或旁分泌信号分子(例如,ATP,NAD1,和谷氨酸)到细胞外介质。目前在哺乳动物中已发现CX家族有至少21个成员,根据CX分子量的不同而命名;根据基因序列同源性程度和胞浆内环状结构域长度的不同可分为不同的亚类,即α、β、及γ类。Cx43属于α-CX亚族,分子质量43kD,Cx43在脑组织中表达最强,星形胶质细胞、活化的小胶质细胞、处于发育阶段的神经元、血管平滑肌和血管内皮细胞上都有分布。多年来一直认为半通道是缝隙连接的一半,不能够独立发挥作用。近些年通过几种试验方法证实半通道能够独立存在。冷冻断裂复制非洲爪蟾蜍卵母细胞胞浆表达Cx50,展示一种新的膜内粒子群(直径约9nm)与全细胞电流有关。使用抗Cx26抗体与Cx26 C端的区域发生反应,免疫荧光发现Cx26定位于一种硬骨鱼水平细胞树突尖端,此处缝隙连接是缺乏的,暗示Cx26可能形成半通道。应用促炎症试剂处理人类多形核细胞,不是静止细胞,通过免疫荧光使用抗体直接作用于Cx43细胞外环1,发现了 Cx43半通道的存在。通过生物素化细胞表面蛋白的蛋白印迹发现骨细胞MLO-Y4的表面存在一定水平Cx43。Cx43半通道的一部分在休息状态时能开放,有一定的生理作用,当在病理环境下变得更加活跃,导致胶质递质(ATP,谷氨酸)的释放,Ca2+、葡萄糖的进入,离子的失衡,细胞容积的超载,甚至在一些情况下,出现细胞死亡。连接蛋白调节通道功能,是动态性和代谢相互作用所必需的,这种相互作用是星型胶质细胞建立与自身和他们界面上神经元与脉管系统之间的作用。事实上,在转基因动物中,有2个主要的星型胶质细胞性连接蛋白,如Cx43和Cx30被删除,展现出钾清除,突触传递和可塑性受损,一种髓鞘形成障碍性表型及血脑屏障完整性丢失。目前为止,使用单Cx基因敲除鼠能提供关键资料证实在神经元迁移中Cx43的作用。在中风,以前的研究提到星型胶质细胞一个可能的作用是扩大损伤。事实上,他们是主要防御兴奋性细胞毒性,通过积极清除谷氨酸。然而,能量耗竭能够逆转转运,随后导致谷氨酸转运体GLT-1的下调,加剧兴奋性细胞毒性。在组织的应激下,星型胶质细胞能够通过GJC播散凋亡信号和HCl信号。在代谢抑制剂诱导的应激下,星型胶质细胞连接蛋白HCl活性增强加剧细胞死亡。在一个体内创伤模型中,损伤后24-72小时,同侧海马中发现增强的Cx43免疫活性,创伤后1小时也检测到磷酸化的Cx43。在海马薄片中,连接蛋白为基础的通道阻滞剂,甘草次酸和辛醇显著降低创伤后细胞死亡。来自Cx43 KO鼠的脑组织薄片,对Cx43使用反义寡核苷酸也观察到类似的结果。在脊髓损伤的研究提过药示Cx43半通道在损伤早期参与。在细胞划痕试验中,细胞在距离划痕约17 mm能获得Cx43半通道调控通讯,并没有GJC依赖的偶联变化。半通道活性的增加是与擦伤后24小时凋亡细胞增加有关,能够被连接蛋白半通道的抑制剂废除。Cx43在脉络丛上皮细胞摄取铅的过程所起的作用,结果显示,通过降低血清条件激活Cx43半通道,能够引起铅浓度的增加。Cx43诱导铅摄取能够被Cx43半通道阻滞剂生胃酮阻断后降低。这些数据确立铅在血脑屏障能够积累,证实Cx43半通道在铅摄取中的作用以及它受Erk磷酸化的调节。多项研究发现脑损伤后星形胶质细胞可表达caspase,其表达量与凋亡指数呈正比,提示亦与神经胶质细胞调亡有关。在脑缺血时,半胱天冬酶级联反应受caspase-3的特异性调节。活化的caspase-3刺激线粒体途径引起凋亡,被认为是神经元凋亡和脑损伤程度的生物标志物。活化的caspase-3能够执行细胞程序性死亡,移除不必要的神经元。在新生脑损伤模型中,药物抑制凋亡能降低损伤,改善运动感觉功能。2研究目的(1)通过新生儿鼠缺氧缺血模型确定Cx43及半通道是否在未成熟脑组织中表达;(2)动态观察体内缺氧缺血后及葡萄糖氧剥夺后Cx43、半通道及caspase-3的变化,以及星型胶质细胞活性的改变,为寻求HIBI的发病机制及治疗方法提供新的理论基础。3材料与方法3.1实验对象(1)新生7日龄Wistar大鼠共80只,体重12-17g,平均体重(14±2.8)g,大鼠雌雄不限,由山东大学实验动物中心提供。(2)人类大脑皮层星型胶质细胞株:购自美国ScienCell研究实验室3.2研究对象分组及模型制备:(1)实验动物分组:健康新生Wistar大鼠80只,7日龄,随机分为5组,即假手术组(Sham组)、缺氧缺血后1h组(T1h组)、缺氧缺血后12h组(T12h组),缺氧缺血后24h组(T24h组),缺氧缺血后48h组(T 48h组)。(2)动物模型制备:7日龄新生Wistar鼠用利多卡因颈部皮肤局部麻醉后,胶布固定乳鼠四肢及头部于操作台面上,剪开颈部正中皮肤,分离皮下脂肪,于胸锁乳突肌内侧的深部分离左颈总动脉,用5-0丝线结扎两端并剪断血管,术中用棉球止血,3-0丝线间断缝合皮肤切口,整个手术约5分钟,假手术组仅给予分离左颈总动脉后,缝合皮肤。术后2小时,持续充以8%氧氮混合气体,气流量约1 L/min,维持3 h,术后放回母鼠身边喂养。动物实验室温度设定为23±1℃,房间固定湿度为60%±10%,12小时照明,12小时黑暗。3.3 HE染色对假手术组,缺氧缺血后1小时组,缺氧缺血后12小时组,缺氧缺血后24小时组及缺氧缺血后48小时组乳鼠脑组织行HE染色。3.4免疫荧光双标记法利用免疫荧光双标记法检测缺氧缺血后1小时组乳鼠脑组织中Cx43 + GFAP,HCl + GFAP的表达。3.5免疫荧光组织化学法利用免疫荧光组织化学法检测假手术组及缺氧缺血后不同时间点各组乳鼠脑组织中 Cx43、Cx43-hemichannel 和 Caspase-3 的表达。3.6免疫印迹法采用免疫印迹法测定假手术组及缺氧缺血后不同时间点各组乳鼠脑组织中Cx43、Cx43-hemichannel 和 Caspase-3 的蛋白含量。3.7细胞培养和转染人类大脑皮层星形胶质细胞细胞株购自ScienCell研究实验室,用Cx43-特异性shRNA进行转染,shRNA星形胶质细胞,由W.H.Moolenaar馈赠,序列为:GGTGTGGCTGTCAGTGCTC;Psup 星形胶质细胞用 GP2-293 包装细胞系(Clontech)磷酸钙沉淀法转染。3.8 糖氧剥夺技术(Oxygen-glucose Deprivation,OGD)细胞培养液暴露于OGD星形胶质细胞的媒体(5%C02/95%N2孵育30分钟)。缺氧是通过将培养液放入培养箱,给予C02/N2(5%,95%)的空气流15分钟,之后,如前所述于置于关闭的培养箱3小时。在37℃,5%C02/95%空气,接近100%湿度的正常培养液中复苏(孵育液最低条件5mmol/L葡萄糖和10%胎牛血清)不同时间点(1、12、24、48小时)。3.9四甲基偶氮唑盐比色法(MTT方法)采用MTT法测定细胞活性,全自动酶标仪测定(测试波长为570nm)各孔吸光度,未经处理的对照组吸光度代表100%,各平行孔取均值后用以下公式计算细胞相对存活率:细胞相对存活率%=(OD实验组/OD正常组)×100。3.10免疫印迹分析星形胶质细胞的表达免疫印迹法检测星型胶质细胞,Psup星形胶质细胞和shRNA星形胶质细胞中对照组和OGD组1小时、12小时、24小时及48小时的蛋白表达。4结果4.1 一般情况与假手术组相比,缺氧缺血后1小时组(T1h),缺氧缺血后12小时组(T12h),缺氧缺血后24小时组(T24h)缺氧缺血后48小时组(T48h)之间体重无统计学差别(P>0.05)。4.2模型成功标志缺氧缺血组乳鼠结扎左颈总动脉后,给予缺氧处理。缺氧约10min,所有乳鼠烦躁不安,活动增多;缺氧15～20min,可以看到乳鼠口鼻周明显发绀,呼吸困难,呼吸频率增快;20～30min出现站立不稳,摇摇摆摆,爬行时下肢拖步;35～60 min乳鼠活动明显减少,全身青紫。1 h后大部分乳鼠出现嗜睡及激惹、抽搐、尖叫,甚至死亡等。4.3脑组织大体观假手术组于假手术后1小时,各组缺氧缺血后乳鼠在相应时间点,给予水合氯醛腹腔注射后,断头取脑;假手术组左右大脑外观对称,无异常改变;缺氧缺血后不同时间点各组脑组织均有水肿,体积增大,左侧脑组织体积较右侧增大,缺氧缺血后48小时组可见左侧脑部分形成坏死液化灶。4.4脑组织HE病理切片染色HE染色可见假手术组神经元细胞形态正常;缺氧缺血后不同时间点神经元细胞不同程度肿胀,排列紊乱,甚至数量减少,细胞间间隙增宽;神经胶质细胞增多,排列紊乱,脑室周围白质组织疏松。4.5乳鼠脑内星形胶质细胞中Cx43+GFAP、HCI+GFAP的表达采用星形胶质细胞特异性标记物GFAP,利用免疫荧光双标记法对乳鼠脑内Cx43、HCl的表达进行鉴定,结果显示GFAP标记的星形胶质细胞在乳鼠脑内能够同时表达Cx43、HCl,HCl的表达水平明显低于Cx43。4.6免疫荧光双标记法检测缺氧缺血损伤后乳鼠脑内Cx43、HCI及Caspase3的表达与假手术组相比,乳鼠脑室管膜下区Cx43、HCl及Casp3的表达在缺氧缺血损伤后呈逐渐增加趋势,缺氧缺血后24小时,48小时的表达均显著增加,具有显著性差异。4.7 免疫印迹检测缺氧缺血损伤后乳鼠室管膜下区Cx43、HCI、Caspase3的表达与假手术组相比,乳鼠脑室管膜下区Cx43、HCl及Casp3蛋白的表达在缺氧缺血损伤后呈逐渐增加趋势,缺氧缺血后24小时,缺氧缺血后48小时的表达明显增加,具有显著性差异。4.8转染逆转录病毒空载体和空Cx43基因对星形胶质细胞的影响Westernblot测定Cx43、HCl和Tublin表达,结果显示转染后Cx43和HCl在星形胶质细胞株内和Pusp星形胶质细胞内均有表达,在shRNA星形胶质细胞内没有表达。4.9检测OGD后Psup星形胶质细胞和shRNA星形胶质细胞细胞活性未给予OGD处理的细胞为对照组,结果显示对照组细胞活性不断增加,OGD后随时间增加,星形胶质细胞株和Psup星形胶质细胞活性明显下降,OGD后24小时,48小时细胞活性下降均明显下降,具有显著性差异;相反,OGD后不同时间点shRNA星形胶质细胞活性没有任何变化。4.10 0GD处理后星形胶质细胞内Cx43、HCI和Casp3的表达结果显示OGD后不同时间点Cx43、HCl和Casp3在星形胶质细胞株和Psup星形胶质细胞内表达增加,尤其以24小时,48小时差异具有显著性;OGD后不同时间点shRNA星形胶质细胞内Cx43、HCl和Casp3的表达没有变化,没有显著性差异。5结论(1)本研究显示Cx43和半通道明显调节脑组织星型胶质细胞内的Casp3,他们在缺氧缺血诱导的星型胶质细胞死亡中具有重要的作用,在细胞死亡的整个过程中互相转换。(2)Cx43和它的半通道可能成为预测早期缺氧缺血性损伤的信号。对于临床来说,阻断或抑制Cx43和其半通道可能有助于神经保护作用。1研究背景孤独症谱系障碍(autism spectrum disorders,ASD)是儿童早期出现的神经发育障碍性疾病,不是单一的疾病障碍,是以社会交往障碍、语言交流障碍和活动内容、兴趣行为刻板重复为特征的多种障碍,同时多伴有一定程度的智力低下。ASD临床证据显示在儿童早期出现,出现持久的致残性神经发育障碍。在2010年,估计患病率为7.6‰或每132人中有1人患病。然而,中国儿童的患病率尚不明确。我国近些年也有一些小范围内的孤独症流行情况的报告。2013年,曾有学者分析近些年大陆、台湾及香港孤独症的调查研究报告,指出孤独症的患病率由之前的2.8/万上升到29.5/万。很多因素如环境、遗传因素、炎症和免疫等可能与孤独症的病因有关。但确切的机制还没有详细阐述。目前许多研究支持,遗传因素是孤独症的重要致病因素。研究者曾发现De Novo基因变异的孤独症患者,远高于一般人群。对双胞胎及其家系的研究认为,孤独症的遗传因素占90%以上,并且具有家族聚集性。细胞遗传学研究发现约2%的ASD患者被检测到染色体异常;有研究认为15q11-q13是ASD患者中最常见的异常频率高的区域,约占ASD患者的1%,并认为该区域可能参与患者社会行为;大约有10%的ASD患者同时患有单基因疾病;在过去的10年里,几十个孤独症易感基因被发现,但只能解释10-20%孤独症患者。这提示我们一方面需要进一步鉴定孤独症的易感基因,同时还需要考虑其他可能导致孤独症发生的病因。国外的许多研究报道显示环境因素,大气污染物,母亲孕期暴露于其中等对孤独症的发生有促进作用。环境因素有可能通过遗传的基因敏感性放大这种不利作用,使ASD发病率增加。重金属、农药、感染、父母亲年龄等也被认为是导致ASD发生的可能因素。神经影像学研究认为通过磁共振成像和头围测量研究发现孤独症儿童早期存在脑过度生长,但后期的脑生长发育缓慢。神经元结构和功能的表观遗传调节对神经系统的发育是重要的,而这种调节的改变或破坏有可能引发许多神经发育疾病,其中包括孤独症谱系障碍。此外,ASD发生潜在的关键机制还包括一些分子通路的调控。有学者提出,免疫因素参与了 ASD,特别值得注意的是在大脑和脑脊髓液(CSF)中存在异常免疫相关分子表达的细胞因子,从而提出,这是在早期发展就存在的一个永久的大脑免疫失调的状态。一种可能性是产妇感染,是孤独症的一个已知的风险因素,激活了免疫反应。星形胶质细胞是中枢神经系统(CNS)中一种主要类型的神经胶质细胞,胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP)是星形胶质细胞中标志性的中间纤丝蛋白。GFAP已在许多神经系统疾病中得到了研究,如视神经脊髓炎、中风、外伤性脑损伤、脑胶质母细胞瘤和帕金森氏病。此外,有研究表明,GFAP可以对于脑外伤和中风的预后信息提供有价值的临床信息,它是疾病发展早期阶段的一种生物标志物。也有研究发现预后差的患者血清GFAP表达增加,但对预测心脏骤停后神经系统预后没有足够的灵敏度。GFAP在ASD的研究报道相对较少。在一些尸检研究中发现ASD患者前扣带回皮层脑白质GFAP免疫反应水平显著升高。动物实验证明在海马CA3特定区区域,GFAP免疫反应是增加的。高同型半胱氨酸被认为是心、脑血管疾病的一个新的危险因子,与血栓形成、血管内皮损伤、炎性反应、脂质代谢异常及氧化应激等密切相关。研究指出,高同型半胱氨酸血症为缺血性卒中的独立危险因素。同型半胱氨酸的代谢与叶酸和维生素B12密切相关,叶酸的缺乏可能与孤独症的发病机制有关。有实验研究表明血浆和血清同型半胱氨酸水平在孤独症患者中均增加。但也有研究认为孤独症患者血浆同型半胱氨酸浓度较低,存在一定争议。大多数ASD患儿伴有不同程度的智力发育落后。有研究表明ASD患者的死亡率是其同年龄同性别非孤独症人群的2.8倍,较高的死亡率可能与孤独症合并症状有关。迄今为止ASD的治疗仍缺乏特异性,给患者家庭带来很大的经济负担和精神压力。因此,尽早了解ASD的影响因素和发病机制,提早预防,减少患病率,具有重要的意义。2研究目的(1)本研究旨在依据上述引起ASD的可能病因,设计针对ASD儿童可能影响因素的调查问卷,了解我市ASD儿童发生的高危因素,探讨儿童出现孤独症表现与儿童一般情况、出生情况、家庭因素及母亲孕期因素等方面的关系。(2)通过比较ASD和对照组儿童血清中GFAP、HCY、CRP的含量,探讨GFAP、HCY在ASD儿童中的潜在作用;确定GFAP的早期诊断价值及临床意义。3研究方法3.1查阅文献,设计调查问卷查阅国内外大量文献,分析ASD儿童的可能影响因素,设计本研究的调查问卷,其内容主要包括四大部分,(1)儿童一般情况;(2)儿童出生情况;(3)儿童父母及家庭情况;(4)母亲孕期情况。3.2确定研究对象收集烟台市烟台山医院2015年1月至12月间ASD患儿,总共75例,年龄2-6岁儿童,同时收集附近幼儿园及儿童保健门诊查体的同年龄、同性别相匹配的正常儿童作为对照组。ASD确诊标准根据精神障碍诊断和统计手册第四版,排除因任何原因接受过药物治疗;伴有其他神经精神系统疾病者;儿童家人存在代谢性疾病、精神病性障碍等疾病;患儿伴有其他重大疾病者。所有对照组儿童来自医院附近幼儿园及儿童保健门诊,由儿科医生进行临床检查。对照组的儿童如存在下列情况将被排除本研究,如果儿童或家人存在内分泌疾病、精神发育迟滞、交往障碍、精神病性障碍,注意缺陷多动障碍和学习障碍。3.3签署知情同意书本研究的准则和知情同意得到了烟台市烟台山医院伦理委员会的批准。研究的细节向参与研究的儿童父母进行了解释,并得到了受试儿童父母的书面知情同意。3.4发放调查问卷对ASD儿童及同年龄、同性别相匹配的正常儿童父母发放调查问卷,获取基本数据资料。3.5进行儿童孤独症评定量表孤独症症状的严重程度使用中文版的儿童孤独症评定量表(CARS)进行测定。所有纳入研究的儿童进行ASD严重程度的评估。3.6 CRP的测定常规进行CRP检查,采用自动化血分析仪测定。3.7 GFAP的检测空腹血液样本进行GFAP检测,采集静脉血5毫升,进行血清分离。离心后,血清被转移至离心管中并存储在-80℃以备测量。血清GFAP的测定使用ELISA商品试剂盒,由一位不知情的同事进行测定。3.8 HCY的测定空腹血液样本同时进行HCY检测,离心后,血清被转移至离心管中并存储在-80℃以备测量。血清同型半胱氨酸(HCY)进行酶循环法测定。4结果4.1 一般资料比较ASD组和对照组儿童,均为汉族,两组性别、年龄匹配,其中男孩59例,女孩16例,男女比例为3.7:1,年龄范围为2岁-6岁(3.75± 1.21)岁,按照1:1病例配对。ASD组与对照组身高、体重两组间比较差异无统计学意义(P>0.05);CARS评分在ASD组是41.7分±6.7,对照组是21.7分±4.4,两组间比较差异具有显著性,有统计学意义(P<0.05)。4.2调查问卷的单因素分析单因素结果分析显示:接触电子产品时间、父亲劳动类型、父亲学历、家庭月收入、家族中是否有少言寡语之人、孕期是否接触电磁辐射、孕期母亲情绪是否经常波动或有重大不良刺激在ASD组和对照组间存在差异,具有统计学意义;4.3调查问卷的条件多因素回归分析经条件多因素回归分析结果显示:接触电子产品的时间、家庭收入、家族少言对ASD有影响,从危险度的估计值来看,家庭收入越多,接触电子产品时间越晚,父母家族中有少言寡语的情感不丰富的人越少患ASD的危险性越小。4.4调查问卷影响因素与ASD严重程度的相关分析调查问卷中影响因素与ASD严重程度的相关分析提示:接触电子产品时间在不同程度的ASD儿童中的分布差异存在统计学意义。4.5血清GFAP、HCY及CRP的测定ASD组和对照组儿童血清GFAP水平测定结果表明,ASD组儿童血清GFAP平均水平显著高于对照组儿童(1.71 ±0.53ng/ml vs.0.99±0.25ng/ml)(P<0.001)。ASD组儿童血清HCY、CRP也显著高于对照组(P<0.01)。4.6 GFAP与CARS评分、CRP、HCY等的相关性血清GFAP水平表达增加,CARS评分定义的ASD严重度也增加。血清GFAP水平和CARS的分数有显著正相关性(r =0.390,P=0.001)。GFAP和CRP水平有相关性(r=0.205,P = 0.011)。血清GFAP水平分别与性别、年龄、BMI、HCY水平无相关性,(P>0.05)。4.7条件多因素Log i st i c回归分析血清GFAP水平与接触电子产品的时间、母亲孕期疾病史有关(P<0.05)。4.8确定GFAP的最佳诊断界值根据受试者工作特征曲线(ROC),血清GFAP含量最佳诊断界限值作为辅助诊断ASD预计为1.28ng/ml,获得较满意结果的敏感性为77.3%,特异性为88.4%,曲线下面积为0.895(95%CI,0.844-0.947)。血清GFAP水平对ASD的影响,发现ASD风险增加与GFAP含量>1.28ng/ml有相关性。5结论(1)本研究从调查问卷方面着手,发现本地区ASD儿童的高危因素与接触电子产品的时间、家庭收入和家族存在少言寡语之人有关。家族中存在少言寡语之人越多,家庭收入越低,接触电子产品时间越早,ASD发生的风险就越高。(2)本研究评估了 ASD儿童血清GFAP、HCY等水平,以及与ASD严重程度的相关性,提示GFAP可能参与孤独症儿童的病理生理,是孤独症儿童疾病有用的生物标记,可作为ASD的早期检测辅助诊断工具。