【摘 要】
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本实验以贵州关岭牛为实验动物,对其MyoD1基因的启动子区进行研究。主要内容包括:根据GenBank中牛的MyoD1基因序列设计PCR引物,采用PCR技术扩增关岭牛MyoD1基因的启动子区,利
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本实验以贵州关岭牛为实验动物,对其MyoD1基因的启动子区进行研究。主要内容包括:根据GenBank中牛的MyoD1基因序列设计PCR引物,采用PCR技术扩增关岭牛MyoD1基因的启动子区,利用转录因子筛选试剂盒筛选出关岭牛MyoD1基因启动子区的转录因子结合位点;根据筛选出的结果,克隆关岭牛MyoD家族的CDS区,并构建重组克隆载体pcDNA3.1(+)-MyoD、pcDNA3.1(+)-MyoG、pcDNA3.1(+)-Myf5、pcDNA3.1(+)-Myf6、pGL3-P1、pGL3-P2、pGL3-P1-MD、pGL3-P2-MD、pGL3-P1-MEF1和pGL3-P2-MEF1,将重组质粒转染小鼠C2C12细胞,检测其30 h后的双荧光素酶活性,分析转录因子MyoD家族和部分转录调控元件对MyoD1基因启动子启动活性的影响。研究结果如下:(1)根据实验筛选出关岭牛MyoD1基因启动子区含有MyoD、TFIID、Pax3、MEF1、MEF2和VDR转录因子结合位点。(2)成功克隆关岭牛MyoD家族的CDS区,构建重组克隆载体pcDNA3.1(+)-MyoD、pcDNA3.1(+)-MyoG、pcDNA3.1(+)-Myf5、pcDNA3.1(+)-Myf6、pGL3-P1、pGL3-P2、pGL3-P1-MD、pGL3-P2-MD、pGL3-P1-MEF1和pGL3-P2-MEF1。(3)重组质粒的转染结果显示,外源过表达转录因子MyoD、Myf5、Myf6均能显著提高关岭牛MyoD1基因启动子全长P1的转录活性(P<0.05);而外源过表达转录因子MyoD家族不能显著提高关岭牛MyoD1基因启动子核心区P2的转录活性。(4)点突变实验表明,关岭牛MyoD1基因启动子核心区的MyoD转录因子结合位点和MEF1元件突变对关岭牛MyoD1基因启动子全长P1转录活性的影响不显著;而重组突变质粒pGL3-P2-MD和pGL3-P2-MEF1在小鼠C2C12细胞中的荧光素酶活性比野生型pGL3-P2高出很多,pGL3-P2的MyoD转录因子结合位点和MEF1元件的突变能使其启动活性明显上调(P<0.01),这2个位点对关岭牛MyoD1基因启动子核心区起着负调控的作用。
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