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背景与目的妊娠滋养细胞肿瘤（Gestationaltrophoblasticneoplasia,GTN）是一类由胎盘绒毛滋养细胞异常增殖而形成的恶性疾病。GTN对化疗敏感,低危患者通常采用单药化疗,生存率接近100%,高危和超高危患者则需多药联合化疗,虽然高危GTN患者治愈率可达90%,但超高危和难治性GTN患者的预后仍较差,约40%的患者死于疾病复发和耐药。免疫治疗已成为继外科手术、放疗、化疗和靶向治疗之后肿瘤治疗的又一重要支柱。已有多项前期研究证明PD-L1在GTN肿瘤细胞广泛表达,少数病例报道的免疫检查点PD-1抑制剂在GTN中的有效率较高,但仍然有患者出现耐药复发的情况,因此需要寻找新的免疫检查点。T细胞激活抑制物免疫球蛋白可变区结构域（V-type immunoglobulin domain-containing suppressor of T cell activation,VISTA）是与 B7 家族的配体 PD-L1 和PD-L2同源,主要表达于髓系细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞,在T淋巴细胞中,VISTA可诱导FOXP3+T细胞,抑制T细胞的活性,VISTA除了表达于肿瘤细胞,还在免疫细胞上表达,既可以作为配体又可以作为受体发挥作用,但这些作用并不排斥,都可通过抑制T细胞的激活、促进Tregs的抑制功能及调节抗原提呈细胞的功能来负性调控T细胞的功能。前期研究已证明VISTA在GTN肿瘤细胞广泛高表达,且与患者的疾病分期、预后评分或预后结局无关,表明VISTA可能作为GTN免疫治疗的潜在靶点,由于免疫治疗在GTN中的研究尚处于初级阶段,为分析免疫治疗在GTN中的治疗效果,进一步探索GTN免疫治疗的新靶点,同时在体内和体外单独或联合阻断PD-1和VISTA,研究其抗肿瘤效应。本研究包括以下三个部分:（1）PD-1抑制剂联合阿帕替尼治疗高危耐药/复发GTN的疗效和安全性分析;（2）妊娠滋养细胞肿瘤浸润免疫细胞（Tumorinfiltrating immunocytes,TIIs）中免疫检查点的表达;（3）联合阻断 PD-1和VISTA在体外和体内对绒癌的抗肿瘤效应研究。方法1.招募至少经过两种及两种以上联合化疗失败的高危耐药/复发GTN、患者FIGO预后评分≥7分,血清β-HCG水平异常的GTN患者共计20例,入组患者口服阿帕替尼联合静脉注射卡瑞利珠单抗。卡瑞利珠单抗:按200 mg/次的剂量静脉注射,每次输注30min（不少于20min,不超过60min,包括冲洗阶段）,每两周1次;阿帕替尼:250mg,每天一次,餐后半小时服用。受试者若能达到完全缓解则在完全缓解后继续维持本治疗方案巩固6个月。主要研究终点为疾病客观缓解率,次要研究终点包括药物安全性,疾病缓解时间和无进展生存期。2.收集2008年1月至2017年12月在北京协和医院行手术治疗、且病理组织学诊断为绒毛膜癌、PSTT和ETT,并有足够的肿瘤样本进行免疫组化的患者病理组织标本共计108例,分析TIIs中免疫检查点VISTA、PD-1、LAG-3、TIM-3、GAL-9的表达水平,分析各靶点在不同GTN病理亚型中表达差异及其与GTN患者预后的关系。3.通过流式细胞术和细胞免疫荧光验证VISTA和PD-L1在绒癌细胞系中的表达,在体外细胞水平单独或联合阻断绒癌细胞中的VISTA和PD-1与T细胞共培养对T细胞增殖和杀伤能力的影响,在免疫系统人源化小鼠体内建立绒癌模型来探讨联合阻断PD-1和VISTA对绒癌的抗肿瘤效应影响。结果1.10例患者在卡瑞利珠单抗联合阿帕替尼治疗期间β-HCG降至正常,中位降至正常的治疗周期为3程（范围,1-6.5程）,平均疾病缓解时间为15个月,总体客观缓解率为55%（95%CI,31.1%-78.9%）,完全缓解率为50%（95%CI,26%-74%）,18例患者发生了任意级别与治疗相关的不良反应（Adverse event,AE）,有12例患者发生了与治疗相关的3级AE,无4级AE发生。最常见的3级AE为高血压（25%）。1例患者因3级AST升高住院治疗而停药出组,未发生治疗相关的死亡,4例患者因皮疹和发热延迟治疗,延迟时间均<14天,1例患者在出现无法控制的高血压后永久停用阿帕替尼。2.VISTA和GAL-9在所有的GTN标本的TIIs中均表达,分别有99.1%、94.4%为中度至强阳性表达;TIM-3和PD-1分别在92.6%、90.1%的TIIs中表达,分别由45例、56例患者为中度至强阳性表达;LAG-3在77.8%的TIIs中表达,其中仅有5例患者为中度至强阳性表达。TIM-3和GAL-9在绒癌中表达高于PSTT,而在绒癌和ETT之间、PSTT和ETT之间表达无显著性差异;LAG-3在ETT中的表达低于绒毛膜癌和PSTT,绒癌和PSTT之间表达强度无显著性差异,TIIs中LAG-3阳性表达的患者PFS更短,差异具有统计学意义。3.VISTA蛋白在JEG-3绒癌细胞的细胞膜和细胞质中高表达,体外联合阻断绒癌细胞中的VISTA和PD-L1后与T细胞共培养可显著恢复T细胞的增殖和杀伤能力,降低FOXP3+T细胞的比例;在免疫系统人源化小鼠绒癌模型体内,与单独阻断VISTA或PD-1相比,联合阻断VISTA和PD-1可显著抑制绒癌皮下肿瘤的生长,使外周血中CD4/CD8细胞比值升高,CD45RO+记忆T细胞比例升高,TILs中PD-1+CD8+T细胞、VISTA+CD8+T细胞和FOXP3+T细胞比例显著降低,CD45RO+记忆T细胞比例显著增高。结论1.PD-1抑制剂卡瑞利珠单抗联合阿帕替尼可作为高危耐药或复发GTN患者的补救治疗,其药物毒性可控,需要长期随访观察其远期疗效。2.VISTA、GAL-9、PD-1和TIM-3在GTN标本TIIs中广泛表达,与患者临床结局无关;LAG-3阳性表达可能是GTN患者预后不良的因素,这些免疫检查点可能是GTN潜在的免疫治疗靶点3.VISTA蛋白在绒癌细胞的细胞膜和细胞质中高表达;联合阻断绒癌细胞中VISTA和PD-L1后与T细胞共培养可显著提高T细胞的增殖和杀伤能力;在免疫系统人源化小鼠模型体内,与单独阻断VISTA或PD-1相比,联合阻断VISTA和PD-1可显著抑制肿瘤的生长。