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目的:心脏干细胞是一类存在于心脏组织中的成体干细胞。随着年龄增长,心脏干细胞的自新和分化能力下降,但是目前对心脏干细胞衰老的分子机制仍不是很明确。Nr1d1是孤儿核激素受体超家族的一员,属于配体激活转录因子,在心脏组织中呈昼夜节律性表达,以血红素依赖的方式参与昼夜节律调节。生物钟紊乱已被证明可加速机体衰老进程。本研究通过分析不同年龄阶段小鼠心脏干细胞的Nr1d1表达变化以及Nr1d1敲低和过表达对心脏干细胞功能的影响,旨在了解和探明Nr1d1在小鼠心脏干细胞衰老中可能的作用及其机制。方法:（1）小鼠心脏干细胞分离:本研究所使用的实验动物为C57BL/6J小鼠。断颈处死实验小鼠,分离心脏并通过机械剪碎及胶原酶Ⅱ处理,制备单细胞悬液。（2）小鼠心脏干细胞分选:新鲜分离的心脏单细胞悬液经荧光标记抗表面标志蛋白抗体组合孵育后,通过流式细胞术分选小鼠心脏干细胞。（3）基因表达分析:通过Real-time PCR检测基因表达情况。（4）Nr1d1表达修饰:用携带Nr1d1-sh RNA或Nr1d1-c DNA的慢病毒转染心脏干细胞,分别敲低或过表达Nr1d1基因。（5）心脏干细胞分化能力检测:利用特定的分化培养基诱导心脏干细胞分化,通过免疫荧光分析检测分化情况。（6）心脏干细胞凋亡检测:细胞经Annexin V和7-AAD染色孵育,流式细胞分析细胞凋亡情况。（7）心脏干细胞增殖能力检测:利用Ed U体外技术测定细胞增殖活性。（8）心脏干细胞周期分析:细胞用7-AAD染色,流式细胞术分析细胞周期时相分布。（9）基因表达谱分析:通过基因芯片法进行,差异表达基因行GO分析和pathway分析。（10）统计方法:使用Graphpad Prism软件对数据进行“one-ANOVA”和“Two-way ANOVA”分析,统计结果以平均值±标准差表示。结果:1)Nr1d1在心脏组织和心脏干细胞中表达的年龄相关性变化。首先分析了Nr1d1在不同年龄阶段小鼠心脏细胞中的表达。结果显示,Nr1d1的表达量随着年龄增加而增加（青年vs老年:1.00±0.00 vs 1.768±0.26,P＜0.05）。我们接下来又测定了Nr1d1在不同年龄阶段小鼠心脏干细胞中的表达。结果显示老年小鼠心脏干细胞中Nr1d1的表达量较青年组显著上升（青年vs老年:1.00±0.00 vs 9.775±0.2,P＜0.01）。这些结果表明Nr1d1的表达在心脏组织中特别是在干细胞群中随着年龄的增加而上调。2)Nr1d1表达修饰对心脏干细胞存活的影响。Nr1d1在老年心脏干细胞中呈上调表达。因此,我们针对分离自老年和青年小鼠的心脏干细胞分别进行了Nr1d1敲低和过表达实验,测试下调Nr1d1是否能够逆转老年心脏干细胞的衰老变化或者上调Nr1d1是否导致青年心脏干细胞发生衰老相关变化。首先我们分析了Nr1d1表达水平改变对心脏干细胞凋亡的影响。敲低Nr1d1表达可导致老年小鼠心脏干细胞凋亡程度降低（敲低组vs对照组:25.27±1.08%vs 31.38±0.32%,P＜0.05）。与此结果相一致,过表达青年小鼠心脏干细胞的Nr1d1后,其凋亡率呈现急剧上升（过表达组vs对照组:38.08±0.48%vs 4.37±1.54%,P＜0.01）。这些结果表明Nr1d1在心脏干细胞的存活中发挥负调控作用。3)Nr1d1表达修饰对心脏干细胞增殖、周期的影响。为更全面的了解Nr1d1在心脏干细胞发育过程中的作用,接着我们分析了Nr1d1表达水平改变对心脏干细胞增殖及周期的影响。结果显示,敲低Nr1d1表达可导致老年心脏干细胞增殖能力升高（敲低组vs对照组:26.4±0.91%vs 21.93±1.19%,P＜0.01）,且处于S期的细胞比例增多（敲低组vs对照组:47.1±3.07%vs 32.61±1.4%,P＜0.01）,处于G2/M期的细胞比例增多（敲低组vs对照组:10.89±1.91%vs 4.94±2.46%,P＜0.05）;同样,过表达青年小鼠心脏干细胞的Nr1d1后,其增殖能力显著降低（过表达组vs对照组:16.03±1.33%vs30.2±2.16%,P＜0.001）,且处于S期的细胞比例减少（过表达组vs对照组:21.51±5.17%vs 44.57±1.58%,P＜0.05）,处于G2/M期的细胞比例减少（过表达组vs对照组:8.78±4.03%vs 19.82±3.71%,P＜0.05）。这些结果表明Nr1d1抑制心脏干细胞的周期和增殖。4)Nr1d1表达修饰对心脏干细胞分化能力的影响。为探明Nr1d1对心脏干细胞分化的作用,我们分析了Nr1d1表达水平改变对心脏干细胞分化能力的影响。结果显示,敲低Nr1d1表达后老年小鼠心脏干细胞的分化能力无明显差异;而Nr1d1过表达后青年小鼠心脏干细胞分化为心肌细胞、平滑肌细胞的能力降低,分化为血管内皮细胞的能力无明显差异。这说明Nr1d1对心脏干细胞的分化并未产生明显影响。5)Nr1d1关联基因的分析。为进一步了解Nr1d1调节小鼠心脏干细胞衰老的分子机制,我们通过基因芯片法测定了青年小鼠心脏干细胞Nr1d1过表达后的基因表达谱。Microarray分析显示,青年小鼠心脏干细胞Nr1d1过表达后有22个基因存在表达差异（FDR＜0.05,P值≤0.05,fold change≥2）,其中11个基因呈上调表达（如:Dpt、Serpina3g、Ahsg、Npr3）,11个基因呈下调表达（如:Star、Nr4a3、Polr2k、Wnk1、Il11）。这些差异表达基因主要参与受体结合、激动剂活性或抑制剂活性调控等过程,而且与细胞因子-细胞因子受体相互作用通路、昼夜节律通路以及类固醇代谢通路等关联。基因互作关系图进一步揭示,Nr1d1可能通过抑制Polr2k表达而诱导心脏干细胞的凋亡。结论:生物钟控制的昼夜节律系统功能紊乱与机体衰老密切相关。本文研究表明,节律基因Nr1d1能够抑制心脏干细胞增殖和存活,但不影响心脏干细胞的分化潜能。因此,我们认为,Nr1d1可能通过促进心脏干细胞凋亡从而加速其衰老进程。Nr1d1调控心脏干细胞衰老的作用及其分子机制的阐释将为心脏年龄相关疾病的解决提供新的临床处置策略。