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伪狂犬病病毒（Pseudorabies viurs,PRV）属疱疹病毒科（Herpesviridae）、α-疱疹病毒亚科（Alpha-herpesviridae）,可致多数动物感染发病,并能引起猪的潜伏感染。猪是其主要宿主和病毒携带者,对养猪业的发展危害重大。在2011年之前,由于PRV gE缺失疫苗的广泛使用,国内的PRV疫情得到了很好的控制,但从2011年底开始,PRV疫情突然大面积爆发,传统的gE缺失疫苗已被证实无法提供完全有效的免疫保护,使得国内养猪业面临巨大的威胁。本研究对PRV新流行毒株进行了分离鉴定,并对其主要糖蛋白的分子特征进行了分析;模仿PRV Bartha株的gE缺失区域,构建了PRV新流行毒株的gE缺失转移质粒,为新流行毒株gE缺失突变株的构建奠定了基础。具体研究内容如下:1、伪狂犬病病毒新流行株的分离鉴定从安徽某免疫PRV Bartha K61疫苗猪场送检的流产胎儿中采集脑、心、肝、脾、肺、肾,经PCR扩增,结果从脑、肝、脾、肺中检测到PRV gE基因阳性。将脑组织研磨后接种BHK-21细胞,在37℃5%CO2培养箱培养48h后,细胞出现了明显的细胞病变,病变细胞经PCR检测为PRV gE阳性;采用空斑纯化方法纯化了该病毒,并命名为PRV AH-China-2013。将病毒接种昆明小鼠,通过LD50测定评价了该病毒对小鼠的致病性,结果表明其LD50为104.15TCID50。2、伪狂犬病病毒新流行株主要糖蛋白的分子特征分析提取PRV AH-China-2013基因组,采用PCR扩增其主要糖蛋白基因g B、g C、g D、gE,经测序后,将g C、gE基因分别与国内外不同年代分离的PRV毒株进行序列比对,通过mega5.0绘制PRV AH-China-2013株g C和gE基因的遗传进化树;通过PRV AH-China-2013 g B、g C、g D、gE序列推导其氨基酸序列,并与国内外不同年代分离的PRV毒株相应糖蛋白序列进行比对分析。遗传进化分析结果显示,PRV AH-China-2013株与国内毒株（除2008年分离的7株毒株外）位于同一个分支,且与2011年来新分离毒株的遗传关系更近,而与与国外毒株及疫苗毒株Bartha株遗传关系较远,表明PRV AH-China-2013株属于PRV新流行毒株。氨基酸序列比对结果显示,与国外毒株相比,国内株主要糖蛋白均存在明显的氨基酸的缺失或插入,且部分突变位点位于相应蛋白的关键功能域内,这些突变是否导致病毒毒力及免疫原性的改变,进而影响现有疫苗的免疫效果,尚需进一步证实。3、伪狂犬病病毒新流行株gE缺失转移质粒的构建根据新流行毒株PRV-ZJ01的基因组序列,在gE基因上、下游设计长度分别为838bp和961bp的基因片段作为同源重组的同源臂,即同源左臂LA和同源右臂RA;以p EGFP质粒为模板,设计引物扩增包含完整表达盒的绿色荧光蛋白基因EGFP作为标记基因。通过酶切、连接、转化等方法,并按照LA-EGFP-RA的顺序,将LA、RA、EGFP连接到T载体的多克隆位点,构建PRV gE缺失转移质粒,经测序正确的质粒命名为p MD-LA-EGFP-RA。将构建好的转移质粒p MD-LA-EGFP-RA转染BHK-21细胞,通过荧光显微镜观察,结果显示转染细胞中可观察到绿色荧光蛋白EGFP的表达,表明构建的转移质粒可以用于后续同源重组试验。本研究从分子水平上解析了PRV新流行株与疫苗株Bartha株主要糖蛋白的遗传差异,为进一步深入研究Bartha株疫苗免疫失败的原因提供了理论依据;成功构建了PRV新流行株的gE缺失转移质粒,为gE缺失突变株的构建及新疫苗的研制奠定了一定的基础。