糖尿病患者的症状主要是胰岛素不能正常在靶细胞中发挥其作用或者出现胰岛素不足的情况,这些引发了单糖、脂肪和蛋白质转化失调,进而水、电解质的代谢紊乱成为全身性疾病。糖尿病有Ⅰ型(胰岛素依赖型)和Ⅱ型(非胰岛素依赖型,其中>90%患者为Ⅱ型糖尿病。成纤维细胞生长因子21(fibroblast growth factor 21,FGF21)是一种新型的参与代谢调控的关键分子。对于增加机体胰岛素敏感性和降低体重均具有十分显著的作用。大量的临床研究结果显示,FGF21是治疗肥胖和2型糖尿病潜在的药物靶点。大肠杆菌是表达重组蛋白最常用的宿主之一。利用大肠杆菌分泌系统胞外表达重组蛋白具有可促进蛋白正确折叠,有效避免蛋白酶降解,简化纯化工序等诸多优势。而且大肠杆菌遗传背景清楚,操作简单,生长周期短,成本低,易于大规模培养。传统方法利用大肠杆菌表达系统进行胞内表达,目前存在问题是蛋白可溶性差,包涵体需要经过变性复性操作,造成生产成本高,且耗时耗力。因此期望通过构建大肠杆菌分泌系统实现FGF21的高效分泌,由于大肠杆菌的Ⅰ型分泌系统是不经过周质空间的,所以可以有效的减少目的蛋白在分泌的过程中造成的损失,而Ⅰ型蛋白的分泌元件主要包括三个部分:HlyA碳端类似信号肽部分、HlyB-HlyD以及TolC。通过构建大肠杆菌Ⅰ型分泌系统来分泌表达FGF21蛋白。通过分泌结果的分析,FGF21蛋白的分泌量较少,期望通过大肠杆菌的Ⅱ型分泌系统来实现FGF21的分泌表达。大肠杆菌的Ⅱ型分泌系统包括信号肽的筛选、分子伴侣共表达以及蛋白酶的敲除三方面。在pET-19d载体上构建好FGF21的质粒后第一步是确定目的蛋白的宿主细胞,大肠杆菌BL21菌株以及其衍生的菌株都广泛的应用于重组蛋白的表达中,由于这类菌株为蛋白酶(例如ompT和lon蛋白酶等)基因缺陷型菌株,它可以有效的避免重组蛋白酶解,ompT蛋白酶可以特异性剪切T7RNA聚合酶,lon蛋白酶则可以快速的降解异源重组蛋白,本实验选择BL21(DE3)常用的宿主菌株作为目的蛋白FGF21的宿主菌株;第二步通过构建七种不同的信号肽malE、ompE、phoA、ompA、lamB、DsbA、TorT来帮助FGF21蛋白的分泌,转入宿主菌BL21(DE3)中摇瓶发酵通过SDS-PAGE电泳检测对分泌效果进行比较,最后确定信号肽ompA更有助于目的蛋白分泌;第三步通过构建不同的分子伴侣与pET-19d-SPompA-FGF21质粒共表达来提高目的蛋白的可溶性,通过摇瓶发酵分析分子伴侣DsbC的共表达可以促进目的蛋白FGF21的分泌;第四步由于重组蛋白在胞内时易被一些蛋白酶降解从而导致目的蛋白量的降低,所以期望通过利用CRISPR/Cas9的基因敲除的方法来敲除某些非必需基因来提高目的蛋白的分泌量,本实验通过查阅文献,了解到大肠杆菌内主要存在蛋白酶有Lon、ClpAP、ClpXP、HslUV、FtsH、OmpT、Prc、DegP、PtrA,通过从BW25113敲除菌库中挑选出相应的蛋白酶缺失菌进行表达FGF21作为理论参考,结果显示Lon、PtrA、HslV、clpP蛋白酶的缺失可能会提高FGF21蛋白的表达量。实验通过CRISPR/Cas9基因编辑技术成功敲除PtrA和HslV这两个基因。由于敲除菌株生长较缓慢且对FGF21的分泌并未产生有利效果。通过将上述筛选到的有效因子进行优化组合,将pET-19d-SPompa-FGF21与分子伴侣DsbC共表达,进行摇瓶发酵,最终FGF21的摇瓶发酵表达量能达到0.3 mg/mL。